腸道菌群通過NLRP3介導(dǎo)神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)rmTBI導(dǎo)致的記憶功能障礙*

汪家文,李佳潔,2,吳 君,吳文鑫,楊 林

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院/法醫(yī)司法鑒定中心,貴陽,550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院/健康醫(yī)藥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,貴陽 550004)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)已成為全球公共衛(wèi)生問題,據(jù)統(tǒng)計全球每年約有1 000萬人受TBI影響[1]。TBI是長期殘疾及多種慢性神經(jīng)性疾病如帕金森病、腦卒中、記憶功能損傷、抑郁和神經(jīng)退行性疾病的主要原因之一[2-4]。中、重度TBI患者一般能得到及時救助,而輕度TBI患者由于器質(zhì)性變化不明顯而延誤治療,進而面臨著重復(fù)損傷的風(fēng)險,即重復(fù)輕度創(chuàng)傷性腦損傷(rmTBI)[5-7]。胃腸道是微生物最多的器官,10萬億～100萬億的微生物生活在結(jié)腸中[8]。已有研究表明,帕金森病、腦卒中、記憶功能損傷和抑郁都與腸道菌群有關(guān),TBI發(fā)生后腸道菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變[9-10]。而rmTBI發(fā)生后腸道菌群如何變化,少見報道。

急性TBI可引起腸道菌群失調(diào),24 h內(nèi)可導(dǎo)致加塞乳桿菌、黃色瘤胃球菌和腹真桿菌數(shù)量明顯減少,而溝真桿菌和福瑪馬文布蘭菌數(shù)量明顯增加[11]。TBI后缺血性腦卒中也會導(dǎo)致嚴重的腸道菌群失調(diào),且與腦損傷的程度和預(yù)后有關(guān)[12-14]。腸道菌群有助于恢復(fù)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和慢性乙醇暴露(CEE)誘導(dǎo)的抑郁樣行為,腸道菌群失調(diào)也可以導(dǎo)致小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而加劇腦損傷[15-16]?；謴?fù)腸道菌群失調(diào),有望給TBI帶來治療效果。

腦-腸-微生物軸三者之間相互作用的改變在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[17]。rmTBI常常伴隨著炎癥的發(fā)生,例如rmTBI發(fā)生后,NLRP3炎癥小體可被激活,從而激活caspase-1,形成活化的炎性體。caspase-1進一步剪切白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18前體,形成其成熟體,并通過消皮素D(gasdermin-D,GSDMD)-N介導(dǎo)的質(zhì)膜孔釋放,從而誘導(dǎo)NLRP3炎性細胞焦亡[18-19]。腸道菌群可通過腦-腸-微生物軸來調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥,而腸道微生物移植能有效地緩解炎癥反應(yīng)從而改善神經(jīng)功能障礙[20-25]。

糞菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)是一種通過把正常糞便中的細菌混合物轉(zhuǎn)移到患者腸道中而引入新的菌群的方法,該法可使脊髓損傷和缺血性腦卒中后的腸道菌群失調(diào)正?；?從而發(fā)揮保護神經(jīng)的作用[13,26-27]。FMT還可通過使TBI后腸道菌群正?；瘡亩_到緩解神經(jīng)功能缺損的作用[28]。FMT能否使rmTBI后腸道菌群正?；纳苧mTBI導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙,尚不清楚。本研究擬通過建立rmTBI大鼠模型,研究大鼠rmTBI后腸道菌群失調(diào)與其神經(jīng)功能障礙的關(guān)系,以及FMT是否能通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1/IL-18炎癥通路來恢復(fù)這種失調(diào),影響神經(jīng)功能效力,從而緩解rmTBI后腸道菌群紊亂、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)功能障礙而發(fā)揮治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SD雄性大鼠購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司。動物操作程序按照動物保護和使用委員會的規(guī)定進行,并經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心批準(批準號:NJMU-1807003)。實驗開始前1周,所有大鼠均于光暗循環(huán)新環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng),大鼠自由獲得食物和水。然后隨機將大鼠分為4組:對照(contorl,con)組,rmTBI組,rmTBI+生理鹽水灌胃(rmTBI+saline)組,rmTBI+糞便溶液灌胃糞菌移植(rmTBI+FMT)組。

1.2 方法

1.2.1rmTBI模型建立

使用單擺撞擊裝置構(gòu)建rmTBI模型。32只大鼠用異氟烷麻醉后將其暴露在單擺撞擊裝置的平臺上進行撞擊。每天進行5次撞擊,連續(xù)進行5 d。

1.2.2FMT治療

FMT懸浮液制備:9:00-11:00取大鼠新鮮糞便,置于-80 ℃冰箱保存。使用前解凍,以生理鹽水稀釋為200 mg/mL的糞便懸浮液,并在標準混合器中均化,置于離心機內(nèi)2 000 r/min離心10 min,收集懸浮液用于FMT。FMT:每天損傷大鼠2 h后對rmTBI+saline組、rmTBI+FMT組大鼠分別進行200 μL生理鹽水和糞便懸浮液灌胃,在rmTBI結(jié)束后繼續(xù)灌胃2 d。

1.2.3Morris水迷宮實驗

將大鼠輕輕放入直徑1.5 m的水池當(dāng)中,池子分為4個象限,水池里的水沒過平臺2 cm,并與鈦白粉混合以隱藏平臺,水溫(25±3)℃。平臺處于第三象限中部,如果大鼠找到逃逸平臺(潛伏期),實驗結(jié)束;若在120 s內(nèi)未找到平臺,則將大鼠引導(dǎo)到平臺上休息15 s,每天3次。分別從第一象限、第二象限、第四象限放入,持續(xù)4 d。于第5 d撤去平臺,隨機選一個象限將大鼠輕輕放入水池中,記錄大鼠60 s內(nèi)的運動路徑、距離、在目標象限停留的時間、穿越平臺的次數(shù)及時間;若60 s內(nèi)未找到平臺,則潛伏期記為60 s。

1.2.4組織處理

各組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉。然后灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)和4%多聚甲醛溶液,仔細解剖、分離大鼠腦組織。部分大鼠腦組織進行腦含水量檢測,其余浸泡于4%多聚甲醛溶液固定1周。取海馬腹側(cè)組織,石蠟包埋、切片并進行免疫組織化學(xué)染色(IHC)及蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2.5腦水腫程度測定

使用干濕法測定大鼠腦水腫程度。使用10%水合氯醛麻醉,經(jīng)心灌注生理鹽水后處死大鼠,取出腦組織,沿正中線切開,分離出左右半球,立即稱濕重。然后放入100 ℃烤箱中48 h烤干,再迅速稱量腦組織干重。計算腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.6HE染色

切片經(jīng)70 ℃烤1 h,依次在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%→80%→60%梯度乙醇脫蠟水合后滴加蘇木素染核,1%鹽酸酒精分化,稀氨水返藍后滴加 1%伊紅染色液,經(jīng)自來水沖洗后脫水透明,中性樹膠封片。

1.2.7ELISA法檢測NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表達水平

取大鼠外周血血清,分別從NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β試劑盒中取出板條,分為標準品孔、0值孔、樣品孔和空白孔,分別在標準品孔、0值孔和樣品孔中加入不同濃度的標準品,樣品稀釋液各50 μL,辣根過氧化物酶(HRP)100 μL,空白孔不加,封板膜封口,恒溫避光孵育1 h。棄去板內(nèi)液體,吸水紙拍干,洗滌液洗滌后向所有孔中加入底物混合液100 μL,恒溫箱避光孵育15 min,加入反應(yīng)終止液50 μL,酶標儀上450 nm處測所有孔的吸光度值(A值)。

1.2.8IHC法檢測大鼠海馬區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、離子鈣接頭蛋白1(Iba-1)表達水平

切片經(jīng)70 ℃烤1 h,用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、100%→80%→60%梯度乙醇脫蠟水合后用3% H2O2孵育,去除內(nèi)源性過氧化物酶,然后置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液中進行高壓修復(fù)。滴加山羊血清封閉液,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min,然后加入各種靶蛋白的一抗,在4 ℃下孵育過夜。一抗包括GFAP(GTX108711,1∶500稀釋,美國Gene Tex公司)和Iba-1(GTX100042,1∶200稀釋,美國Gene Tex公司)。在PBS中沖洗3次后,滴加山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。PBS洗3次用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯示信號,用蘇木素對細胞核進行雙染色,然后在自來水下沖洗15 min.最終脫水透明后用中性樹膠封口。

1.2.916S rRNA測序

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(TianGen)提取大鼠糞便DNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的純度及濃度。按照常規(guī)流程操作方法獲 得PCR擴增產(chǎn)物,使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,對合格的PCR產(chǎn)物進行磁珠純化,通過酶標定量法根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度進行等量混樣,充分混勻后再使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用通用型DNA純化回收試劑盒(TianGen)回收目的條帶產(chǎn)物。使用NEB Next?UltraTMⅡ FS DNA PCR-free Library Prep Kit(New England Biolabs)構(gòu)建文庫,對構(gòu)建好的文庫進行Qubit和實時熒光定量PCR(qPCR)定量,待文庫檢測合格后,使用NovaSeq 6000進行PE250上機測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 rmTBI后大鼠記憶功能障礙及FMT的治療作用

大鼠的水迷宮蹤跡見圖1A。結(jié)果顯示,rmTBI可引起記憶功能障礙,表現(xiàn)為:大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01,圖1B),潛伏期明顯增長(P<0.001,圖1C);使用FMT干預(yù)后,大鼠的記憶功能得到了恢復(fù)(圖1B、C)。4組大鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1D),排除了大鼠因為游泳能力不同導(dǎo)致空間記憶功能差異的可能性。

A:代表性大鼠蹤跡圖;B:大鼠穿越平臺次數(shù)組間比較;C:大鼠第1次找到平臺時間(潛伏期)組間比較;D:大鼠游泳速度組間比較;①:con組;②:rmTBI組;③:rmTBI+saline組;④:rmTBI+FMT組;*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001;ns:P>0.05。

2.2 FMT改善rmTBI后腦水腫程度

con組、rmTBI組、rmTBI+saline組、rmTBI+FMT組腦含水量分別為77.3%±0.9%、80.3%±1.2%、81.9%±1.5%、76.4%±2.1%,rmTBI組和rmTBI+saline組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),相比于con組明顯增多(P<0.05);與rmTBI組和rmTBI+saline組相比,rmTBI+FMT組大鼠腦含水量明顯減少(P<0.05)。

2.3 組織病理學(xué)改變

病理學(xué)結(jié)果顯示:與con組相比,rmTBI組、rmTBI+saline組、rmTBI+FMT組大鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞及腦血管周隙明顯增寬;與rmTBI組、rmTBI+saline組相比,經(jīng)FMT治療后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞及腦血管周隙明顯減小,腦水腫程度明顯減輕,見圖2。

圖2 海馬區(qū)病理學(xué)改變(HE染色)

2.4 ELISA法檢測大鼠血清中NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達

血清學(xué)結(jié)果顯示:與con組相比,rmTBI組及rmTBI+saline組大鼠血清NLRP3、caspase-1、IL-18表達水平均明顯升高(P<0.01),rmTBI組大鼠血清IL-1β表達水平明顯升高(P<0.01)。rmTBI組和rmTBI+saline組大鼠組間血清NLRP3、caspase-1、IL-18表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),IL-1β表達水平較rmTBI組明顯降低(P<0.05)。與rmTBI組及rmTBI+saline組相比,經(jīng)FMT干預(yù)治療后,大鼠血清NLRP3、caspase-1、IL-18表達水平均明顯降低(P<0.05)。與rmTBI組相比,FMT干預(yù)后大鼠血清IL-1β表達水平明顯降低(P<0.001),與rmTBI+saline組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

A:大鼠血清NLRP3水平組間比較;B:大鼠血清caspase-1水平組間比較;C:大鼠血清IL-18水平組間比較;D:大鼠血清IL-1β水平組間比較;①:con組;②:rmTBI組;③:rmTBI+saline組;④:rmTBI+FMT組;*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,****:P<0.000 1;ns:P>0.05。

2.5 IHC檢測大鼠海馬區(qū)GFAP、Iba-1表達水平

IHC檢測大鼠海馬區(qū)GFAP、Iba-1表達,結(jié)果顯示:rmTBI組和rmTBI+saline組大鼠海馬區(qū)GFAP、Iba-1表達水平無明顯差異(P>0.05)。與con組相比,rmTBI組和rmTBI+saline組大鼠海馬區(qū)GFAP、Iba-1表達水平明顯升高(P<0.05)。與rmTBI組和rmTBI+saline組相比,rmTBI+FMT組大鼠海馬區(qū)GFAP、Iba-1表達水平明顯降低(P<0.05),見圖4。

A:隨機選取不同標本同一位置0.1 mm×0.1 mm面積內(nèi)Iba-1陽性表達統(tǒng)計分析;C:隨機選取不同標本同一位置0.1 mm×0.1 mm面積內(nèi)GFAP陽性表達統(tǒng)計分析;①:con組;②:rmTBI組;③:rmTBI+saline組;④:rmTBI+FMT組;*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001;ns:P>0.05。

2.6 門分類水平豐度分布

根據(jù)物種注釋結(jié)果,在門水平上選取排名前10的門從高到低分別是:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteriota)、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)、黏菌門(Myxococcota)。其中厚壁菌門、擬桿菌門均大量存在于各個樣品中,所占比例高,是構(gòu)成腸道菌群的優(yōu)勢菌門。除此之外,各個樣品的菌門所占比例也不相同。例如rmTBI組樣品4中厚壁菌門相對豐度高達67%;con組樣品3中擬桿菌門相對豐度高達58%。

2.7 屬分類水平豐度分布

在屬分類水平上,豐度排名前10的菌屬依次是:乳酸菌屬(Muribaculaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、普氏菌屬(Prevotella)、毛螺球菌科-NK4A136屬(Lachnospiraceae-NK4A136-group)、普雷沃菌科-Ga6A1屬(Prevotellaceac-Ga6A1-group)、理研菌科-RC9屬(Rikenellaceae-RC9-gut-group)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭狀芽胞桿菌-UCG-014屬(Clostridia-UCG-014)、瘤胃菌屬(NK4A214-group)。每個樣品間菌屬構(gòu)成比例差異較大。例如:con組樣品2中Muribaculaceae屬相對豐度為45%;con組樣品5中Muribaculaceae屬相對豐度為23%,Muribaculaceae屬在大鼠個體間差異較大。

2.8 腸道菌群、神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)炎癥相關(guān)性分析

腸道菌群、神經(jīng)功能障礙與神經(jīng)炎癥存在不同的相關(guān)性。腸道菌群變化與神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)炎癥具有一定相關(guān)性,表現(xiàn)為Shannon指數(shù)與大鼠潛伏期(r=-0.810)、GFAP(r=-0.721)、Iba-1(r=-0.680)呈負相關(guān),與穿越平臺次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.723);Simpson指數(shù)與GFAP呈負相關(guān)(r=-0.628)。神經(jīng)功能障礙與神經(jīng)炎癥也具有一定相關(guān)性,表現(xiàn)為潛伏期與GFAP(r=0.809)、Iba-1(r=0.803)呈正相關(guān),穿越平臺次數(shù)與GFAP(r=-0.832)、Iba-1(r=-0.749)呈負相關(guān)。除此之外,腸道菌群失調(diào)與神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)炎癥等多項指標均存在不同的相關(guān)性,見表1。

表1 Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、炎癥因子、記憶功能障礙指標相關(guān)性分析(r)

3 討 論

腸道菌群受多因素的影響,包括性別、遺傳因素、飲食、年齡、藥物和壓力等。近年來,TBI模型已被用于研究腸道微生物組中宿主與微生物之間的相互作用,從而加深對大腦與腸道菌群之間相互調(diào)節(jié)機制的理解。腸道菌群失調(diào)可通過腦-腸-微生物軸影響神經(jīng)功能,因此神經(jīng)功能障礙患者更易發(fā)生腸道菌群失調(diào),如認知功能障礙、神經(jīng)免疫功能等神經(jīng)功能障礙[29-30]。在rmTBI發(fā)生后腸道菌群改變,表現(xiàn)為有益菌[如嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia)、糖化假絲酵母菌(Candidatus-Saccharimonas)等]減少而有害菌(如Romboutsia)增多,這種紊亂可導(dǎo)致神經(jīng)行為改變,進而導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。

rmTBI常常伴隨著神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)炎癥是機體的一種防御反應(yīng)機制,適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)炎癥可通過促進組織修復(fù)與除去細胞碎片而對大腦起到保護作用,相反,持續(xù)的炎癥反應(yīng)會激活固有免疫細胞,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[31],進而產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙。研究表明,小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞是神經(jīng)炎癥中最重要的三類細胞,神經(jīng)炎癥加重了抑郁、阿爾茨海默病、認知功能障礙和神經(jīng)退行性疾病等神經(jīng)功能障礙的發(fā)生,調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞-小膠質(zhì)細胞之間的交互對話可以維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整性,從而達到維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和治療神經(jīng)退行性疾病的目的[32-34]。

腦小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的激活受多種因素的影響。Iba-1是一種鈣結(jié)合蛋白,可以特異性地結(jié)合巨噬細胞和激活的小膠質(zhì)細胞;GFAP作為主要的炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病標志物,主要存在于成熟的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)。本研究證實,當(dāng)rmTBI發(fā)生后,腸道菌群穩(wěn)態(tài)被破壞,小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞被激活。腸道菌群失調(diào)可間接影響小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞功能的促炎和抗炎細胞因子循環(huán)水平的改變。當(dāng)腸道菌群的復(fù)雜結(jié)構(gòu)受到破壞時,小膠質(zhì)細胞尤其受到影響。研究表明,神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞合作促進小膠質(zhì)細胞分支,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞特征基因表達[35]。當(dāng)神經(jīng)元所處的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破時,則會釋放出“信號”分子,通過配體-受體的結(jié)合,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化[36]。

腸道微生物成員的細菌產(chǎn)物或代謝物如三甲胺、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞成熟、形態(tài)和功能的關(guān)鍵因子[37-38]。SCFAs可能通過腸黏膜進入體循環(huán)中,進而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能。本研究結(jié)果證實,糞便微生物移植可以抑制小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的激活,進而減少神經(jīng)元細胞的焦亡,改善神經(jīng)功能障礙。然而,腸道菌群影響小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞激活的機制尚不清楚,推測可能與腸道微生物成員的細菌產(chǎn)物或者代謝物有關(guān),如三甲胺、SCFAs等?？傊?本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對rmTBI后神經(jīng)炎癥和神經(jīng)功能障礙至關(guān)重要,FMT減少了神經(jīng)炎癥的發(fā)生,改善了rmTBI后的神經(jīng)功能障礙,為腸道微生物在大腦損傷后固有免疫系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)提供了證據(jù),有助于理解和治療rmTBI后神經(jīng)炎癥和認知功能損傷、抑郁、空間記憶功能損傷和阿爾茨海默病等神經(jīng)功能障礙。

rmTBI可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào),表現(xiàn)為腸道菌群豐度增多而多樣性下降,有益菌數(shù)量減少而致病菌增多,NLRP3/caspase-1/IL-18炎癥通路被激活,同時導(dǎo)致記憶功能損傷;而FMT能有效地使失調(diào)的腸道菌群正?；?同時調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1/IL-18炎癥通路使其表達下調(diào),并對rmTBI造成的記憶功能損傷具有恢復(fù)作用。