探討姜黃素在抑制脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生的應(yīng)用價(jià)值

袁曉軍 徐文華 李廣 林軍明 甘心榮

黃韌帶骨化(ossification of ligamentum flavum, OLF)在臨床較多見, 好發(fā)于胸椎, 常壓迫脊髓致神經(jīng)功能受損, 嚴(yán)重者出現(xiàn)癱瘓。血管生成是黃韌帶骨化的重要原因之一, 而研究發(fā)現(xiàn)VEGF 在誘導(dǎo)血管生成中起重要作用。姜黃素是從姜科姜黃屬植物根莖姜黃(turmeric)中提取的一種植物多酚, 藥性穩(wěn)定且無相關(guān)毒副作用, 除了有抗炎及抗氧化效果外, 還具備一定抗腫瘤價(jià)值, 受到臨床的高度關(guān)注。近年來, 隨著臨床研究的深入, 發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-9 是姜黃素抗血管生成的重要機(jī)制；姜黃素呈時(shí)間依賴性抑制腹水腫瘤細(xì)胞VEGF-1 和VEGF-2 基因的表達(dá)。目前對(duì)姜黃素的研究多集中于對(duì)腫瘤的研究, 但關(guān)于姜黃素對(duì)黃韌帶骨化的發(fā)生發(fā)展影響的研究較少。探討姜黃素對(duì)黃韌帶骨化中血管生成的作用研究, 有助于更好地認(rèn)識(shí)黃韌帶骨化的發(fā)生原因, 為姜黃素可能成為一種臨床中具有治療黃韌帶骨化的中藥提供理論依據(jù)［1,2］。為此, 本文選取40 只脊柱黃韌帶骨化大白兔為研究對(duì)象, 對(duì)姜黃素在抑制脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生的應(yīng)用價(jià)值分析并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取40 只脊柱黃韌帶骨化大白兔為研究對(duì)象, 本次訂購(gòu)的大白兔來自于江蘇省農(nóng)科院, 雌雄不限, 大白兔平均體質(zhì)量(2.44±0.15)kg, 將所有大白兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組2、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組1、對(duì)照組1, 每組10 只。其中, 姜黃素為上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑三廠所產(chǎn), 阿托伐他汀鈣的生產(chǎn)廠家為輝瑞公司, 其他試驗(yàn)材料包括：Weigert 氏間苯二酚品紅染液, 隨機(jī)引物(random primer), 麗春紅S 染色液,上海華美所產(chǎn)的RNA 酶抑制劑 RNasin Ribonuclease Inhibitor, 上海放射免疫分析技術(shù)研究所所產(chǎn)的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)放射免疫分析試劑盒, Takara 所產(chǎn)的EX Taq DNA 聚合酶(EX Taq DNA Polymerase), 南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所所產(chǎn)的丙二醛測(cè)定試劑盒, M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase)(promega), JEM-1010 型透射電鏡JE.OL,北京祥瑞生物制品股份有限公司所產(chǎn)的白細(xì)胞介素-6放射免疫試劑盒, 采用722 分光光度計(jì)。

1. 2 方法 大白兔先行模型構(gòu)建, 即建立黃韌帶骨化模型：參照陳雄生等方法, 以中國(guó)大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)作為誘導(dǎo)物, 將BMP-2 明膠海綿復(fù)合載體植入黃韌帶下方間隙。試驗(yàn)組1 植入含姜黃素的復(fù)合載體, 對(duì)照組1 植入含PBS的復(fù)合載體, 試驗(yàn)組2 灌胃姜黃素, 對(duì)照組2 灌胃生理鹽水, 生理鹽水劑量為5 ml/d, PBS 復(fù)合載體組應(yīng)用含聚丁二酸丁二醇酯干預(yù), 使用劑量為2.0 mg/(kg·d), 在持續(xù)干預(yù)4 周后檢查四組大白兔的黃韌帶中血管增生情況。

1. 3 觀察指標(biāo) 在持續(xù)干預(yù)4 周后檢查四組大白兔的黃韌帶血管增生情況, 比較四組VEGF、MMP-9、MVD、白細(xì)胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、p53、Caspase-3 水平。再將大白兔喂養(yǎng)5 周后應(yīng)用烏來糖實(shí)施麻醉處理, 劑量為1 g/kg, 并實(shí)施心臟穿刺抽血, 采集血液樣本后放置在試管, 于37℃環(huán)境中水浴30 min, 常規(guī)進(jìn)行離心血清分離, 應(yīng)用自動(dòng)生化分析儀(日本)對(duì)血脂水平進(jìn)行檢測(cè), 將一部分血清放入冰箱備檢, 對(duì)超氧化物歧化酶、丙二醛、白細(xì)胞介素-6 等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè), 對(duì)脂質(zhì)降解物當(dāng)中所含有的丙二醛結(jié)合硫代巴比妥酸做氧化處理后產(chǎn)生紅色產(chǎn)物, 通過硫代巴比妥酸比色法對(duì)丙二醛含量進(jìn)行檢測(cè),血清中的超氧化物歧化酶含量檢測(cè)通過放射免疫法進(jìn)行, 白細(xì)胞介素-6 水平檢測(cè)采用平衡法, 常規(guī)病理及彈力纖維染色的具體步驟為：在大白兔飼養(yǎng)第4 周末,應(yīng)用烏來糖對(duì)大白兔進(jìn)行麻醉, 依次完成椎管切開, 行黃韌帶組織分離, 并對(duì)組織行VEGF［積分光密度(IOD)值］和MMP-9 檢測(cè)、組織分離、甲醛固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法(HE)染色、Weigert彈力纖維染色［3,4］。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較 四組VEGF、MMP-9 水平由高到低為：對(duì)照組2＞試驗(yàn)組2(對(duì)照組1)＞試驗(yàn)組1, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；試驗(yàn)組2、對(duì)照組1＞試驗(yàn)組1, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；試驗(yàn)組2 與對(duì)照組1 比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較( ±s)

表1 四組VEGF、MMP-9、MVD 水平比較( ±s)

注：與對(duì)照組2 比較, aP＜0.05；與試驗(yàn)組1 比較, bP＜0.01

組別只數(shù)VEGF(pg/ml)MMP-9(μg/L)MVD(個(gè)/mm2)對(duì)照組210833.55±123.3952.45±4.7443.55±4.42試驗(yàn)組210364.26±33.63ab 44.19±3.52ab 37.26±4.58ab對(duì)照組110359.14±33.47ab 43.25±3.37ab 34.14±4.52ab試驗(yàn)組110 92.63±12.88a 33.76±2.37a 25.63±3.91a

2. 2 四組白細(xì)胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較 對(duì)照組2 白細(xì)胞介素-6 均高于試驗(yàn)組2、對(duì)照組1 和試驗(yàn)組1, 且試驗(yàn)組1 均低于試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1；試驗(yàn)組1 超氧化物歧化酶均高于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1；試驗(yàn)組1 的丙二醛均低于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 且對(duì)照組2 均低于試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 四組白細(xì)胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較( ±s)

表2 四組白細(xì)胞介素-6、超氧化物歧化酶、丙二醛水平比較( ±s)

注：與對(duì)照組2 比較, aP＜0.01；與試驗(yàn)組1 比較, bP＜0.01

組別只數(shù)白細(xì)胞介素-6(ng/L)超氧化物歧化酶(μg/L)丙二醛(μmol/L)對(duì)照組210827.53±59.86273.68±70.59b 6.63±1.53b試驗(yàn)組210 715.41±50.81ab224.74±56.55b12.98±2.62ab對(duì)照組110 713.58±47.64ab225.28±54.17b11.75±2.54ab試驗(yàn)組110 642.88±40.21a 652.63±150.432.22±0.34

2. 3 四組血脂水平比較 對(duì)照組2 甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平均高于試驗(yàn)組2、對(duì)照組1、試驗(yàn)組1, 高密度脂蛋白膽固醇均低于試驗(yàn)組2、對(duì)照組1、試驗(yàn)組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表3 四組血脂水平比較( ±s, mmol/L)

表3 四組血脂水平比較( ±s, mmol/L)

注：與對(duì)照組2 比較, aP＜0.01

組別只數(shù)甘油三酯低密度脂蛋白膽固醇總膽固醇高密度脂蛋白膽固醇對(duì)照組2101.69±0.180.57±0.051.98±0.160.68±0.05試驗(yàn)組210 1.15±0.16a 0.45±0.04a 1.54±0.14a 0.81±0.07a對(duì)照組110 1.22±0.11a 0.45±0.04a 1.56±0.15a 0.80±0.08a試驗(yàn)組110 0.92±0.09a 0.32±0.02a 1.06±0.09a 0.98±0.09a

2. 4 四組p53、Caspase-3 水平比較 通過電鏡檢查結(jié)果顯示試驗(yàn)組1 存在明顯的平滑肌細(xì)胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表4。

表4 四組p53、Caspase-3 水平比較( ±s)

表4 四組p53、Caspase-3 水平比較( ±s)

注：與試驗(yàn)組1 比較, aP＜0.01

組別只數(shù)p53Caspase-3對(duì)照組2100.3941±0.2082a0.4487±0.1102a試驗(yàn)組2100.4071±0.1439a0.9656±0.1183a對(duì)照組1100.4068±0.1447a0.9671±0.1159a試驗(yàn)組1100.6887±0.23851.4087±0.1628

3 討論

黃韌帶骨化雖由Double 于1912 年首先發(fā)現(xiàn)并描述, 在東方人種發(fā)病多見, 日本報(bào)道發(fā)生率最高達(dá)34%。OLF 在頸、胸、腰椎均可發(fā)生, 但以下胸椎多見,是胸椎管狹窄癥的主要原因, 導(dǎo)致神經(jīng)根、脊髓損傷或受壓, 出現(xiàn)肢體感覺異常、肌力下降等嚴(yán)重后果［5,6］。

黃韌帶骨化的典型病理變化為軟骨內(nèi)化骨, 早期階段表現(xiàn)為纖維結(jié)構(gòu)排列順序混亂, 彈性纖維程度逐漸下降, 膠原纖維產(chǎn)生了明顯變化(異常增生、腫脹、黏液性變樣), 隨著病情發(fā)展會(huì)演變?yōu)辄S韌帶組織當(dāng)中的未分化間充質(zhì)產(chǎn)生了細(xì)胞軟骨性變化, 并導(dǎo)致出現(xiàn)纖維軟骨細(xì)胞, 軟骨逐漸進(jìn)入鈣化狀態(tài)并隨著新生血管的出現(xiàn), 機(jī)體當(dāng)中的鈣鹽結(jié)晶體緩慢鈣化、骨化［3］。黃韌帶骨化的原因較多, 包括生物力學(xué)改變、解剖與力學(xué)因素、退變因素、炎性細(xì)胞因子等因素［4］, 以骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)所起作用最明顯。研究發(fā)現(xiàn), 正常情況下, 韌帶當(dāng)中并不存在太多的微血管, 韌帶、骨化移行區(qū)域則有大量微血管存在, 同時(shí)還有CD34+內(nèi)皮組細(xì)胞, 提示血管生成在韌帶由正常向變性階段進(jìn)展過程中發(fā)揮作用, 鈣化區(qū)域的肥大軟骨細(xì)胞, 在分泌生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)、刺激之下生成諸如VEGF 的血管, 新生血管會(huì)增加間質(zhì)細(xì)胞濾過、基質(zhì)礦化, 這都是骨化出現(xiàn)的重要前提, 而骨橋蛋白等是鈣化成熟的標(biāo)志, 在相關(guān)研究中提出, 局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞分泌的有利環(huán)境(缺氧、VEGF 的高表達(dá))在損傷康復(fù)中扮演重要角色, 顯示了VEGF 促進(jìn)骨生成和血管生成的效果, BMPs 發(fā)揮著不可忽視的介導(dǎo)價(jià)值［7,8］。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物的根莖姜黃中提取的一種植物多酚, 目前對(duì)其作用機(jī)制的研究多集中于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞粘附及運(yùn)動(dòng)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、核因子-κB(NF-κB)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(u-PA)的影響, 抑制血管的生成［9,10］?；|(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-9 是姜黃素抗血管生成的重要機(jī)制。還有研究發(fā)現(xiàn), 姜黃素抑制腹水腫瘤細(xì)胞VEGF-1 和VEGF-2基因的表達(dá)呈時(shí)間依賴性［11,12］。本次研究結(jié)果顯示,對(duì)照組2 甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、白細(xì)胞介素-6 均高于試驗(yàn)組2、對(duì)照組1、試驗(yàn)組1,高密度脂蛋白膽固醇均低于試驗(yàn)組2、對(duì)照組1、試驗(yàn)組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。黃韌帶血管增生程度也最高。四組VEGF、MMP-9 水平由高到低為：對(duì)照組2＞試驗(yàn)組2(對(duì)照組1)＞試驗(yàn)組1, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；試驗(yàn)組2、對(duì)照組1＞試驗(yàn)組1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；試驗(yàn)組2 與對(duì)照組1 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。試驗(yàn)組1 超氧化物歧化酶均高于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 試驗(yàn)組1 的丙二醛均低于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 且對(duì)照組2 均低于試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通過電鏡檢查結(jié)果顯示試驗(yàn)組1 存在明顯的平滑肌細(xì)胞凋亡, 其凋亡基因p53、Caspase-3 均高于對(duì)照組2、試驗(yàn)組2 和對(duì)照組1, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

綜上所述, 姜黃素對(duì)脊柱黃韌帶骨化過程中血管增生具有抑制作用, 分析其原因可能是由于姜黃素能夠抑制VEGF、MMP-9 的表達(dá), 抑制脊柱黃韌帶的發(fā)生發(fā)展。