敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態(tài)變化對哮喘大鼠氣道上皮屏障修復(fù)作用的研究

許洋洋 王文麗

支氣管哮喘簡稱哮喘, 是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞成分介導(dǎo)的過敏性疾病, 以患者慢性氣道炎癥為特征,其中氣道重塑是哮喘最重要的病理改變之一, 其主要發(fā)病機(jī)制是氣道炎癥和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制失衡, 其呈現(xiàn)漸進(jìn)發(fā)展, 是導(dǎo)致不可逆氣流受限和持續(xù)性氣道高反應(yīng)的重要因素, 也是患者出現(xiàn)激素抵抗的關(guān)鍵原因, 最終誘發(fā)慢性難治性哮喘。研究表明, 細(xì)胞中存在復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, Wnt7B/β-catenin 信號通路存在于許多組織和細(xì)胞的增殖和分化中, 通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的代謝、生長、增殖、凋亡和其他生命活動, 調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和粘附因子對機(jī)體的影響, 參與哮喘氣道重塑, 對哮喘氣道炎癥和重塑具有非常重要的作用,最新研究發(fā)現(xiàn), 其在哮喘的氣道炎癥和重塑中起著非常重要的作用［1-3］。近幾年, 中醫(yī)中藥治療哮喘效果顯著?；诖? 本文選取36 只無特定病原體級健康雄性SD 大鼠, 研究敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態(tài)變化對哮喘大鼠氣道上皮屏障的修復(fù)作用, 研究報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取36 只無特定病原體級健康雄性SD大鼠(遼寧長生生物有限公司提供), 隨機(jī)分為正常對照組、模型組、激素治療組、敏咳方治療組, 每組9 只。本研究獲得本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1. 2 方法 正常對照組大鼠不施加任何干預(yù)因素,自由食水, 采用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。模型組大鼠采用卵清蛋白氫氧化鋁溶液致敏并激發(fā), 將大鼠放于清潔動物房內(nèi)室溫下常規(guī)飼養(yǎng)7 d, 自由食水, 記錄大鼠體重、呼吸、進(jìn)食水量、肛溫情況, 實(shí)驗(yàn)開始第1 天與第8 天腹腔注射卵清蛋白(國藥編號69003835, 原廠貨號69003835, 國藥集團(tuán))氫氧化鋁溶液(國藥編號20001060, 原廠貨號20001060, 國藥集團(tuán))1 ml(內(nèi)含卵蛋白100 mg 及氫氧化鋁200 mg), 致敏大鼠, 第15 天開始, 隔日卵清蛋白生理鹽水溶液霧化14 次, 激發(fā)大鼠, 每次激發(fā)時間為20 min, 對大鼠進(jìn)行風(fēng)痰瘀哮喘模型建立, 取其肺常不足, 肺虛易感外風(fēng)：煙熏法使大鼠感受外風(fēng), 以高脂飲食、長期激怒法致肝風(fēng)內(nèi)動、痰瘀互結(jié)。激素治療組大鼠在模型組基礎(chǔ)上加激素進(jìn)行治療, 造模第16 天起開始給藥, 大鼠放入透明霧化箱中, 噴入吸入用布地奈德混懸液(商品名：普米克令舒)生理鹽水溶液, 吸入量為0.06 ml/100 g體重, 濃度為20%, 1 次/d, 共15 d。敏咳方治療組大鼠在模型組基礎(chǔ)上加敏咳方進(jìn)行治療, 造模第16 天起開始給藥, 霧化攻擊前30 min 灌胃給藥, 非霧化日常規(guī)給藥, 連續(xù)給藥15 d。敏咳方：麻黃10 g、黃芩10 g、杏仁10 g、石膏5 g、蟬衣10 g、地龍10 g、僵蠶10 g、鉤藤10 g、白芍10 g、半夏10 g、陳皮5 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、黃芪10 g、白術(shù)10 g、防風(fēng)10 g、甘草5 g、生地黃10 g、玄參10 g、麥冬10 g。模型組、激素治療組、敏咳方治療組每日灌胃等效劑量, 1 次/d,共15 d。正常對照組灌胃等量生理鹽水。造模30 d 各模型組大鼠繼續(xù)卵清蛋白致敏, 繼續(xù)激怒、煙熏、高脂飲食、給藥, 造模15 d。造模第45 天(遷延期), 各組隨機(jī)取2 只大鼠取材檢測指標(biāo)。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較四組大鼠Wnt7B、β-catenin 及支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度、OVA-sIgE 水平。采用圖像分析技術(shù)測定大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度, ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 水平,qRT-PCR 法測定Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)。①支氣管壁厚度和平滑肌厚度的檢測, 選取每只大鼠3 支直徑為1～1.5 mm 的支氣管, 使用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(ImageproPlus)測定大鼠肺組織內(nèi)支氣管總面積(Wat1)、支氣管管腔面積(Wat2)、支氣管基底膜周徑(Pbm)、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積(Wam2)和平滑肌外緣內(nèi)氣管面積(Wam1), 用支氣管基底膜周徑做標(biāo)準(zhǔn)化處理, 其中支氣管壁厚度=(支氣管總面積-支氣管管腔面積)/支氣管基底膜周徑；支氣管平滑肌厚度=(平滑肌外緣內(nèi)氣管面積-平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積)/支氣管基底膜周徑。采用qRT-PCR 法檢測Wnt7B、β-catenin 表達(dá),按照試劑盒(北京伊塔)說明, 將大鼠肺組織總核糖核酸(RNA)用勻漿器將組織磨碎, 加入TRIzol 處理組織。5 min 后加入氯仿, 以12000 r/min 離心5 min 后測定RNA 濃度及純度, 根據(jù)濃度取2 μg 總RNA, 按照試劑盒操作說明, 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的脫氧核糖核酸(cDNA), 取其產(chǎn)物以20 μl 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔, 以95℃預(yù)變性90 s, 95℃退火5 s,58℃延伸30 s, 共40 個循環(huán), 獲得各樣本待測基因的Ct 值后用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 計算正常對照組相對于模型組、激素治療組、敏咳方治療組的基因表達(dá)倍數(shù)變化。ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 的表達(dá), 按照試劑盒(上海鑫樂生物)說明書操作步驟, 利用酶標(biāo)儀按照450 nm 波長測量各孔的OD 值, 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品OVA-sIgE。以上指標(biāo)檢測在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒實(shí)驗(yàn)室完成, 動物實(shí)驗(yàn)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心完成。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示,采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin比較 模型組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均大于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；激素治療組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均小于模型組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；敏咳方治療組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均小于激素治療組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin 比較( ±s)

表1 四組大鼠Wnt7B、β-catenin 比較( ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05；與激素治療組比較, cP＜0.05

組別只數(shù)Wnt7Bβ-catenin正常對照組9 1.00±0.011.00±0.01模型組910.03±1.23a 1.95±0.27a激素治療組9 5.32±0.42b 1.42±0.18b敏咳方治療組9 4.93±1.03c 1.33±0.21c

2. 2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較 模型組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度大于正常對照組, OVA-sIgE 水平高于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；激素治療組和敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度小于模型組, OVA-sIgE 水平低于模型組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度均小于激素治療組, OVA-sIgE 水平低于激素治療組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較( ±s)

表2 四組大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及OVA-sIgE 水平比較( ±s)

注：與正常對照組比較, aP＜0.05；與模型組比較, bP＜0.05；與激素治療組比較, cP＜0.05

組別只數(shù)支氣管管壁厚度(μm2/μm)支氣管平滑肌厚度(μm2/μm)OVA-sIgE(ng/ml)正常對照組927.44±2.9212.58±0.9932.12±3.92模型組9 58.12±7.71a 25.38±1.56a 117.22±19.21a激素治療組9 41.51±3.39b 22.27±0.91b 67.59±7.92b敏咳方治療組9 37.12±3.21bc 20.11±0.89bc 59.51±6.39bc

3 討論

支氣管哮喘是一種涉及多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的異質(zhì)性疾病, 以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為主要特征的、嚴(yán)重危害公眾健康的呼吸道疾病, 其特征是慢性氣道炎癥和氣道重塑, 其臨床表現(xiàn)包括患者出現(xiàn)陣發(fā)性喘息、呼吸短促、胸悶、咳嗽等［4］。哮喘的發(fā)生與患者氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān), 其中氣道炎癥的持續(xù)發(fā)作介導(dǎo)炎癥細(xì)胞對氣道黏膜下層的趨化性,氣道上皮的反復(fù)損傷和修復(fù), 導(dǎo)致氣道成纖維細(xì)胞過度增殖和轉(zhuǎn)化, 最終導(dǎo)致氣道重塑, 并且氣道成纖維細(xì)胞的過度增殖也會促進(jìn)纖維粘蛋白和膠原的合成, 從而損害纖毛清除和局部防御功能, 導(dǎo)致大量病原菌生長繁殖, 而加重氣道炎癥［5,6］。氣道滯留的黏液為細(xì)菌生長提供了良好的培養(yǎng)基, 容易引起呼吸道感染, 難以控制［7,8］。哮喘被認(rèn)為是一種與適應(yīng)性免疫應(yīng)答激活有關(guān)的疾病, 其最突出的表現(xiàn)是Th2 細(xì)胞依賴性促進(jìn)免疫球蛋白產(chǎn)生, 其中Wnt/β-catenin 信號通路與哮喘氣道炎癥密切相關(guān), 并且哮喘還以先天性免疫反應(yīng)為特征, 影響樹突狀細(xì)胞(DC 細(xì)胞)的轉(zhuǎn)運(yùn)、先天性免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞的啟動, 其均與Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān), Wnt/β-catenin 信號通路與哮喘氣道重塑也密切相關(guān)［9,10］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),β-catenin 可通過過度的支氣管拉伸β-catenin 激活,并通過細(xì)胞增殖參與哮喘的組織修復(fù), 氣道上皮細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)生成, 因此, β-catenin 激活是氣道重塑的關(guān)鍵機(jī)制［11］。Wnt7B 是Wnt 信號通路配體之一, 主要在肺組織上皮中表達(dá), 在胚胎期參與肺發(fā)育,其可調(diào)節(jié)肺平滑肌細(xì)胞的發(fā)育, 其表達(dá)失衡與氣道重塑密切相關(guān)［12］。哮喘屬于中醫(yī)“哮病”的范疇, 其主要病機(jī)為“伏痰”內(nèi)結(jié), 遇感引觸, 壅阻肺氣, 肺失宣肅, 氣道攣急。課題組多年的兒科臨床及科研發(fā)現(xiàn), 與普通外感疾病急性期邪實(shí)、恢復(fù)期正虛病機(jī)演變規(guī)律不同, 兒童哮喘的發(fā)病體現(xiàn)了虛實(shí)夾雜的病機(jī)特點(diǎn)。風(fēng)(內(nèi)風(fēng)、外風(fēng))、痰瘀、虛(氣虛、陰虛)是導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的病機(jī)關(guān)鍵, 貫穿哮喘疾病發(fā)病始終。小兒為稚陰稚陽之體, 素體肺常不足, 肺虛易感外風(fēng), 哮喘患兒病初見鼻塞、咽癢、流涕、鼻癢, 為外風(fēng)襲肺。采用咳敏方對大鼠進(jìn)行治療, 蟬衣、地龍、僵蠶、鉤藤熄風(fēng)；白芍養(yǎng)肝柔肝；麻黃、黃芩、杏仁、石膏為《傷寒論》名方, 治療哮喘效果顯著；半夏、陳皮、茯苓健脾化痰；黃芪、白術(shù)健脾；生地黃、玄參、麥冬滋陰；牡丹皮、赤芍清熱涼血；防風(fēng)疏散風(fēng)熱；甘草調(diào)和諸藥。以上藥物同用起到滋陰、清熱、健脾、息風(fēng)、止喘的作用。

實(shí)驗(yàn)中qRT-PCR 法測定Wnt7B、β-catenin 的表達(dá), 結(jié)果顯示, 模型組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均大于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；激素治療組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均小于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；敏咳方治療組Wnt7B、β-catenin 的表達(dá)均小于激素治療組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見激素治療和中藥咳敏方治療均可以抑制Wnt7B、β-catenin 的表達(dá), 但是咳敏方效果更加顯著。實(shí)驗(yàn)中大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及ELISA 法檢測血清OVA-sIgE 水平, 結(jié)果顯示, 模型組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度大于正常對照組, OVA-sIgE 水平高于正常對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；激素治療組和敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度小于模型組, OVAsIgE 水平低于模型組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；敏咳方治療組支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度均小于激素治療組, OVA-sIgE 水平低于激素治療組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見激素治療可以對大鼠支氣管管壁厚度、支氣管平滑肌厚度有改善作用,可降低血清OVA-sIgE 水平, 敏咳方治療組優(yōu)于激素治療組。

綜上所述, 敏咳方通過Wnt/β-catenin 信號通路及免疫因子動態(tài)變化調(diào)節(jié)哮喘大鼠氣道上皮屏障修復(fù)作用, 療效顯著。