外周血microRNA-27a 與缺血性腦卒中的相關(guān)性及診斷價(jià)值分析

趙樂 楊挲挲 陳志會(huì) 查江杰 李夢真 程銘 韓鵬飛

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)又被稱之為腦梗死, 主要由顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄和大腦中動(dòng)脈閉塞引起［1］, 是一種因大腦供血供氧不足而引起的疾病。每年,腦血管破裂、缺血或中風(fēng)導(dǎo)致全球超過4000 萬人殘疾［2］, IS 是當(dāng)前導(dǎo)致成年人癱瘓或者殘疾的一個(gè)主要誘因［3］。微小RNA(miRNA)是一類基因序列高度保守的內(nèi)源性核苷酸非編碼RNA, 其與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)發(fā)生特異性結(jié)合之后, 會(huì)對蛋白質(zhì)翻譯產(chǎn)生一定的抑制作用, 甚至還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生降解, 在轉(zhuǎn)錄后對蛋白質(zhì)的表達(dá)起到一定的調(diào)節(jié)控制作用, 這對于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)控制是至關(guān)重要的［4］。microRNA-27a 在調(diào)節(jié)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起作用, 在肺癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著上調(diào)［5-8］, 調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而microRNA-27a 在IS 中的相關(guān)研究成果還不是很多。本研究通過測定microRNA-27a 在IS 患者和健康對照者外周血中的差異表達(dá), 分析外周血中microRNA-27a的相對表達(dá)量與NIHSS 評分是否具有相關(guān)性以及對IS的診斷效能, 旨在為IS 探索新型生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2021 年9 月～2022 年7 月在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為IS 的90 例患者作為IS 組, 根據(jù)NIHSS 評分不同分為輕度組(0～4 分)、中度組(5～13 分)和重度組(14～42 分), 每組30 例；選擇同期體檢中心45 例健康體檢者為對照組。IS 組中男58 例, 女32 例；平均年齡(60.40±5.76)歲。對照組中男27 例, 女18 例；平均年齡(59.56±4.68)歲。IS 組和對照組一般資料比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。本研究所有受試者均知曉研究目的、主要內(nèi)容和具體方法等, 并簽訂知情同意書；本研究獲得牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。IS 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)(1995 年版)》中明確的IS 診斷標(biāo)準(zhǔn), 且根據(jù)臨床資料和磁共振成像(MRI)首次診斷為IS；②年齡45～70 歲；③簽訂知情同意書。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡45～70 歲；②既往無IS 或短暫性腦缺血(TIA)、無急性冠狀動(dòng)脈綜合征等心血管疾病的同期體檢中心體檢的健康人群。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦卒中或腦外傷既往史者；②短暫性腦缺血發(fā)作；③出血性腦卒中和腦腫瘤患者；④肺纖維化、內(nèi)分泌代謝疾病、免疫或炎癥性疾病、慢性心血管、肝腎功能損傷者。

1. 2 方法

1. 2. 1 主要試劑 三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司提供, TRIpure Total RNA Extraction Reagent、EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 和EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix試劑盒購自ELK Biotechnology。

1. 2. 2 RNA 提取 量取體積為500 μl 的全血置于體積規(guī)格為15 ml 的離心管中, 之后加入10 倍體積的紅細(xì)胞裂解液, 充分混勻, 常溫避光10 min。之后在常溫條件下對300 g 的混合液進(jìn)行10 min 的離心處理, 棄掉上清液, 之后再重復(fù)操作1 次。利用磷酸緩沖液(PBS)對細(xì)胞液進(jìn)行重懸, 之后在常溫條件下對300 g 的混合液進(jìn)行10 min 的離心處理, 棄掉上清液, 使用體積為100 μl的 PBS 對細(xì)胞再次進(jìn)行重懸, 加入體積為1 ml 的TRIpure 溶液, 充分混勻, 常溫避光5 min, 加入體積為250 μl 的三氯甲烷溶液, 緩慢搖晃直至混合均勻, 在冰塊上靜置5 min。在溫度為4℃的條件下對10000 g 的混合溶液進(jìn)行10 min 的離心處理。之后在超凈工作臺(tái)上抽取體積為500 μl 的上清液, 將其轉(zhuǎn)移到1.5 ml 的EP 管中, 然后加入在溫度為4℃的條件下經(jīng)過預(yù)冷處理的500 μl 的異丙醇, 緩慢搖晃直至混合均勻, 置于溫度為-20℃的條件下靜置15 min。在溫度為4℃的條件下對10000 g 的混合溶液進(jìn)行10 min 的離心處理, 然后去掉上清液, 加入1 ml 在溫度為4℃的條件下經(jīng)過預(yù)冷處理的75%乙醇, 緩慢顛倒搖晃多次之后, 使用緩沖液清洗RNA 沉淀, 在溫度為4℃的條件下對10000 g的混合溶液進(jìn)行5 min 的離心處理, 棄掉上清液后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上進(jìn)行干燥處理, 幾分鐘后待乙醇完全揮發(fā), 加入體積為100 μl 的RNase-Free Water, 使RNA得到充分溶解。

1. 2. 3 第一鏈cDNA 合成 第一鏈cDNA 的合成借助于EntiLink? 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒完成,在冰上完成反應(yīng)溶液的配制工作后, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為70℃的PCR 儀上反應(yīng)5 min, 再迅速放到冰塊上靜置2 min；在冰上完成反應(yīng)溶液的配制工作后, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為42℃的PCR 儀上反應(yīng)60 min, 之后轉(zhuǎn)移到溫度為85℃的PCR 儀上反應(yīng)5 min, 最后置于溫度為4℃的條件下保存。

1. 2. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是在Life technologies公司的QuantStudio 6 Flex System PCR儀上完成, 每個(gè)樣品都準(zhǔn)備3 個(gè)復(fù)孔, 借助于EnTurbo?SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒完成, 本研究以H-U6作為內(nèi)參基因, 運(yùn)用2-ΔΔCT法分析每個(gè)樣品中目的基因相對表達(dá)量。擴(kuò)增條件設(shè)定為：預(yù)變性95℃, 30 s,循環(huán)(40 次)95℃, 10 s →58℃, 30 s →72℃, 30 s, 采用儀器默認(rèn)的熔解曲線來分析程序。各基因的引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1. 3 觀察指標(biāo) 對比IS 組與對照組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量, IS 組不同病情嚴(yán)重程度患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量；分析IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量與NIHSS 評分的相關(guān)性, microRNA-27a 對IS 的診斷效能。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；運(yùn)用GraphPad Prism 8 軟件繪制ROC 曲線, 評估m(xù)icroRNA-27a對IS 的診斷效能。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 IS 組與對照組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量對比 IS 組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量為(0.77±0.54), 顯著低于對照組的(1.76±1.26), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。見圖1。

圖1 兩組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量對比

2. 2 IS 組不同病情嚴(yán)重程度患者外周血microRNA-27a相對表達(dá)量對比 輕度組患者外周血microRNA-27a相對表達(dá)量為(1.08±0.66), 中度組為(0.75±0.27), 重度組為(0.48±0.45)。輕度組患者外周血microRNA-27a相對表達(dá)量高于中度組、重度組, 中度組高于重度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 輕、中、重度組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量對比

2. 3 IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量與NIHSS 評分的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析顯示：IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量與NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.54, P＜0.01)。見圖3。

圖3 IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量與NIHSS 評分的相關(guān)性分析

2. 4 microRNA-27a 對IS 的診斷效能分析 將IS 作為狀態(tài)變量, 將microRNA-27a 作為檢驗(yàn)變量, 結(jié)果顯示：microRNA-27a 的AUC 為0.818, 截?cái)嘀禐?.965,特異度為75.60%, 靈敏度為76.70%。見圖4。

圖4 microRNA-27a 對IS 診斷效能的ROC 曲線

3 討論

IS 是發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家致殘和死亡的第二大原因, 自2010 年以來, 每年約有550 萬人死亡, 預(yù)計(jì)到2030 年將增加24.9%, 而且50%的幸存者患有慢性殘疾, 同時(shí)IS 的發(fā)病率也正在增加, 全球≥65 歲人口的增長速度快于所有其他年齡組, 此外, 腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)正在向較年輕人群轉(zhuǎn)移, 特別是在低收入和中等收入國家［9］, 這給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來了巨大的財(cái)政負(fù)擔(dān)。目前, 診斷IS 主要依靠的是腦影像學(xué)檢查和典型臨床癥狀, 但是約50%的IS 在影像學(xué)診斷中缺乏特異性, 而且影像學(xué)檢查會(huì)對患者的身體造成一定的損傷, 其安全性低于分子生物學(xué)檢查［10］, 此外, 還尚無單獨(dú)診斷IS 的高效且特異的血液學(xué)生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床［11-13］。然而, 藥物和手術(shù)治療對IS 的有益效果有限, IS 的主要治療方法是立即恢復(fù)血液供應(yīng), 但這可能會(huì)加劇腦缺血再灌注損傷 (IRI) 引起的腦損傷［14］, 雖然重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)一直是挽救缺血組織的中流砥柱, 但由于治療窗口窄、經(jīng)濟(jì)支出高和出血相關(guān)并發(fā)癥的局限性, 只有少數(shù)IS 患者能夠真正從中受益［15］。因此, 探索IS 的新型生物標(biāo)志物至關(guān)重要, 旨在為IS 的治療提供新的方向。

microRNA-27a 位于人類19 號染色體［16］, 具有相對穩(wěn)定性、特異性和可重復(fù)性的特性［17］, 所以是IS 比較有前途的生物標(biāo)志物, 比蛋白更適合用于疾病的診斷。目前, 國內(nèi)外學(xué)者對microRNA-27a 的研究大多數(shù)都是圍繞惡性腫瘤疾病開展的, 在心腦血管疾病及IS 相關(guān)危險(xiǎn)因素疾病中意義的研究也比較多, 而對于IS 的相關(guān)研究相對較少, 且大多數(shù)研究者采用的都是動(dòng)物模型(MCAO 模型)和體外細(xì)胞模型氧葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)模型對IS 進(jìn)行研究, 在IS患者外周血中的研究幾乎還處于空白階段。本研究結(jié)果顯示, 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測定IS 患者和健康者外周血microRNA-27a 的表達(dá)水平, IS 組外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量為(0.77±0.54), 顯著低于對照組的(1.76±1.26), 差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。表明, IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量低, 這與Li 等［18］、Dai 等［19］和Liu 等［20］的研究結(jié)果一致。IS 組根據(jù)NIHSS 評分不同分為輕度組、中度組、重度組, 輕度組患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量為(1.08±0.66), 中度組為(0.75±0.27), 重度組為(0.48±0.45)。輕度組患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量高于中度組、重度組, 中度組高于重度組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Pearson 相關(guān)性分析顯示：IS患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量與NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.54, P＜0.01)。表明, IS 患者外周血中microRNA-27a 表達(dá)水平有助于判斷疾病的嚴(yán)重程度, IS 患者的病情越嚴(yán)重, 外周血中microRNA-27a 表達(dá)水平越低。繪制ROC 曲線來評估IS 患者外周血中microRNA-27a 的診斷效能, 以此來判斷microRNA-27a作為診斷IS 的生物標(biāo)志物的潛力, 結(jié)果顯示,microRNA-27a 的AUC 為0.818, 截?cái)嘀禐?.965, 靈敏度為76.70%, 特異度為75.60%, 證明microRNA-27a 對IS 的診斷效能尚可, 外周血microRNA-27a 有望成為診斷IS 的新型生物標(biāo)志物。

microRNA 作為腦卒中未來的靶向治療手段, 其療效優(yōu)于傳統(tǒng)的治療方法, 靶向基因治療的潛力不僅在神經(jīng)保護(hù)誘導(dǎo)方面更先進(jìn), 而且在更安全無毒的靶向治療方面也更先進(jìn)［4］。然而, 目前對外周血microRNA-27a 在IS 中的研究僅處于初步探索階段, 對其在IS 中的保護(hù)或損傷機(jī)制還尚未可知。Cai 等［21］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在IS 體外細(xì)胞模型中, microRNA-27a 通過靶向FOXO1 來抑制IRI, 所以外周血microRNA-27a在IS 中調(diào)控的靶基因和完整的靶向軸還需要未來大量的臨床樣本和實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證, 以期為IS 的治療提供新的思路。部分蛋白標(biāo)志物與IS 的脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)等存在相關(guān)性, 對IS 進(jìn)行早期輔助診斷和預(yù)后評估等方面具有重要意義。在以往的研究中, 對于microRNA 和蛋白標(biāo)志物聯(lián)合檢測的文獻(xiàn)還比較少, 因此, 探尋在IS 中與外周血microRNA-27a 表達(dá)水平具有相關(guān)性的蛋白標(biāo)志物, 并且與其進(jìn)行聯(lián)合檢測或可提高對IS 的診斷效能。

綜上所述, microRNA-27a 與IS 的發(fā)生有關(guān), IS 患者外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量低于健康者；外周血microRNA-27a 相對表達(dá)量有助于判斷IS 患者的病情嚴(yán)重程度, 且對IS 具有一定的診斷價(jià)值。所以,microRNA-27a 在作為IS 的血液學(xué)生物標(biāo)志物和有效的治療手段方面具有巨大潛力。