腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)研究△

王玉濤，趙 莉

1 濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院周圍血管病科，山東 濟(jì)南 250012

2 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250014

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是血管外科重癥之一，具有病程長(zhǎng)、起病隱匿等特點(diǎn)，漏診率高。大多數(shù)AAA 患者為查體時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，部分患者于出現(xiàn)腰腹疼痛癥狀后確診。AAA 破裂的首發(fā)癥狀多為腰腹疼痛，預(yù)后極差，病死率為60%~90%[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化、炎性反應(yīng)、遺傳因素是近年來關(guān)于AAA 形成的主要學(xué)說[3]。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，通過分析AAA 樣本的差異性表達(dá)基因，提高了對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)[4]，但AAA 相關(guān)的細(xì)胞亞群及相關(guān)基因表達(dá)變化仍未明確。隨著單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，高分辨率的組學(xué)信息能夠更為精確地挖掘疾病的潛在機(jī)制，基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的AAA 發(fā)病機(jī)制探索結(jié)果更為可信[5]。本研究擬通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組生物信息挖掘思路，探索AAA 發(fā)生的潛在機(jī)制，為其基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與質(zhì)控

以“abdominal aortic aneurysm”為關(guān)鍵詞，從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索AAA 樣本的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集，選取單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集基因表達(dá)序列（gene expression series，GSE）166676為研究對(duì)象。選取單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中4例AAA 患者（AAA 組）和2例健康者（nonAAA 組）的腹主動(dòng)脈樣本單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，使用R語言的Seurat數(shù)據(jù)包的“Normalizedata”和“LogNormalize”函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用Seurat數(shù)據(jù)包的“ScaleData”函數(shù)過濾計(jì)數(shù)﹥5000或﹤200的細(xì)胞，從而過濾線粒體基因比例高于15%的細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞聚類

使用Seurat 數(shù)據(jù)包的“ScaleData”函數(shù)過濾具有特殊分子標(biāo)識(shí)的細(xì)胞，使用“RunPCA”函數(shù)進(jìn)行降維分析，篩選特征基因并將單細(xì)胞聚類。使用t-分布鄰域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding，tSNE）對(duì)各細(xì)胞亞群數(shù)據(jù)進(jìn)行降維整合處理，并將轉(zhuǎn)錄組信息降維投影到二維，直觀地觀察細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)錄多樣性，將類似基因表達(dá)模式的細(xì)胞分群。

1.3 細(xì)胞注釋

使用Seurat數(shù)據(jù)包的“FindAllMarkers”函數(shù)尋找每個(gè)細(xì)胞亞群的特異性基因，利用R語言SingleR數(shù)據(jù)包的“HumanPrimaryCellAtlasData()函數(shù)”對(duì)不同的細(xì)胞亞群進(jìn)行注釋。

1.4 細(xì)胞提取和差異基因

根據(jù)tSNE聚類和細(xì)胞注釋結(jié)果，利用Seurat數(shù)據(jù)包篩選出兩組單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異顯著的細(xì)胞亞群，同時(shí)借助FindMarkers函數(shù)篩選差異顯著細(xì)胞亞群中兩組單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用分析

將篩選獲得的差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），挖掘差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件中的cytoHubba功能篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，提取核心靶點(diǎn)的表達(dá)量并進(jìn)行可視化。

1.6 功能富集分析

登陸歐易生信分析平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.cn/task/），將篩選出的差異基因進(jìn)行基因本體功能注釋（gene ontology，GO）富集和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析通路分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

本研究分析了GSE166676數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，其中，基因表達(dá)矩陣（gene expression series matrix，GSM）5077727、GSM5077728、GSM5077729、GSM5077730為AAA組測(cè)序數(shù)據(jù)，GSM5077731、GSM5077732為正常腹主動(dòng)脈樣本（nonAAA組）測(cè)序數(shù)據(jù)。根據(jù)線粒體基因過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，經(jīng)主成分分析（principle component analysis，PCA）去批次處理，質(zhì)控并過濾后得到12 307個(gè)細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，其中AAA組細(xì)胞7432個(gè)，nonAAA組細(xì)胞4875個(gè)。（圖1）

圖1 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)清洗與質(zhì)量控制

2.2 細(xì)胞聚類

篩選具有特殊分子標(biāo)識(shí)符的細(xì)胞，利用“RunPCA”函數(shù)進(jìn)行降維分析，篩選各基因群的特征基因繪制小提琴圖，篩選各基因群前3位標(biāo)志性基因表達(dá)量繪制熱圖。12 307個(gè)細(xì)胞聚類成18個(gè)亞群，使用tSNE法對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行降維整合處理，并將轉(zhuǎn)錄組信息降維投影到二維，直觀地觀察到細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)錄多樣性，將類似基因表達(dá)模式的細(xì)胞分群。（圖2）

圖2 各細(xì)胞亞群?jiǎn)渭?xì)胞簇分布

2.3 細(xì)胞注釋

利用Seurat數(shù)據(jù)包的“FindAllMarkers”函數(shù)和SingleR數(shù)據(jù)包的“HumanPrimaryCellAtlasData()函數(shù)”對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行注釋并繪制比例柱狀圖，結(jié)果顯示，兩組樣本細(xì)胞類別存在顯著差異，AAA 組樣本細(xì)胞類別包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等；nonAAA 組樣本類別包括上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。T細(xì)胞、B細(xì)胞在AAA 組樣本中占比較高，可能在AAA 發(fā)病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。（圖3）

圖3 兩組樣本細(xì)胞亞群相關(guān)情況

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)繪制和潛在核心基因篩選

根據(jù)tSNE聚類和細(xì)胞注釋結(jié)果，利用Seurat數(shù)據(jù)包FindMarkers函數(shù)篩選兩組單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中T細(xì)胞、B細(xì)胞相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中差異表達(dá)上調(diào)基因120個(gè)，差異表達(dá)下調(diào)基因200個(gè)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.9.1軟件繪制差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選潛在核心基因，結(jié)果顯示，C 型蛋白酪氨酸磷酸酶受體（protein tyrosine phosphatase receptor type C，PTPRC）、T細(xì)胞受體復(fù)合物CD3δ 亞基（CD3 delta subunit of T-cell receptor complex，CD3D）、B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物相關(guān)蛋白β鏈（B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain，CD79B）、T細(xì)胞受體復(fù)合物的CD3 ε亞基（CD3 epsilon subunit of T-cells receptor complex gene，CD3E）、T細(xì)胞表面糖蛋白CD3 ζ 鏈（T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain，CD247）是差異表達(dá)上調(diào)基因的潛在核心基因；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、纖維連接蛋白1（fibronectin 1，F(xiàn)N1）、組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）、膜連蛋白A5（annexin A5，ANXA5）、半胱蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）是差異表達(dá)下調(diào)基因的潛在核心基因，提取潛在核心基因的表達(dá)量進(jìn)行可視化。（圖4）

圖4 差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)及核心基因

2.5 差異基因功能富集分析

登陸歐易生信分析平臺(tái)（https://cloud.oebiotech.cn/task/），將篩選出的差異基因進(jìn)行GO 功能富集和KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)上調(diào)基因共富集得到106條信號(hào)通路，以P﹤0.05為條件，篩選獲得39條信號(hào)通路；差異表達(dá)下調(diào)基因共富集得到217條信號(hào)通路，以P﹤0.05為條件，篩選獲得37條信號(hào)通路。根據(jù)富集強(qiáng)度，取排名前10位的信號(hào)通路進(jìn)行可視化，結(jié)果表明，AAA 形式可能與輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1細(xì)胞分化、Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞凋亡、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等途徑相關(guān)。（圖5）

圖5 T細(xì)胞和B細(xì)胞相關(guān)差異表達(dá)基因GO和KEGG信號(hào)通路富集分析

3 討論

3.1 T 細(xì)胞在AAA 形成中的作用

研究顯示，隨著AAA病程進(jìn)展，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞逐漸向腹主動(dòng)脈外膜浸潤(rùn)，其中淋巴細(xì)胞占比較高，且超過50%的淋巴細(xì)胞為CD4+和CD8+T細(xì)胞[6]。T細(xì)胞對(duì)AAA的調(diào)節(jié)作用依賴于Th1細(xì)胞因子（如干擾素-γ、IL-2和腫瘤壞死因子β）以及Th2細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10）[7]，上述細(xì)胞因子均與巨噬細(xì)胞激活、血管平滑肌細(xì)胞凋亡和腹主動(dòng)脈管壁破壞有關(guān)[8]。血管平滑肌細(xì)胞是主動(dòng)脈壁的主要細(xì)胞成分，Th可通過自身免疫途徑參與血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。Th1釋放的腫瘤壞死因子和干擾素-γ可抑制膠原蛋白的合成，Th2表達(dá)的Fas配體可加速血管平滑肌細(xì)胞凋亡[9]，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能受損可能會(huì)促進(jìn)AAA 的發(fā)展[10]。Zhou 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可以釋放IL-10，抑制炎癥細(xì)胞的趨化作用，參與動(dòng)脈壁重塑和血管生成。另有研究表明，AAA 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例明顯低于對(duì)照組[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞在AAA 組樣本中占比較高，可能是治療AAA 的潛在靶細(xì)胞。

3.2 B 細(xì)胞在AAA 形成中的作用

B 細(xì)胞通過分泌抗體在體液免疫中發(fā)揮重要作用，B細(xì)胞可分為3個(gè)亞群，包括B-1、B-2和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞[13]。Schaheen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用CD20抗體耗盡B1和B2細(xì)胞可顯著限制AAA 模型小鼠瘤體的生長(zhǎng)。B細(xì)胞還可以分泌免疫球蛋白，免疫球蛋白廣泛沉積在小鼠AAA 組織中，這些自身抗體不僅能誘導(dǎo)T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，導(dǎo)致主動(dòng)脈壁破壞[15]，還可以與其他免疫細(xì)胞相互作用，如免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E可以影響巨噬細(xì)胞的極化，并誘導(dǎo)被激活的肥大細(xì)胞合成各種彈性蛋白酶[16]。B 細(xì)胞還可直接誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，與T細(xì)胞相互作用，參與AAA 形成。B細(xì)胞可通過表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶直接促成血管壁基質(zhì)層的蛋白水解[17]。Meher等[18]研究證實(shí)B-2細(xì)胞可通過上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和減少單核細(xì)胞的數(shù)量來抑制B細(xì)胞缺陷模型小鼠AAA 形成。本研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞在AAA 組樣本中占比高，可能在AAA 形成中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。目前，B細(xì)胞在AAA 中作用的相關(guān)研究較少，B細(xì)胞、免疫球蛋白的調(diào)節(jié)與AAA 的相關(guān)性可能是新的研究熱點(diǎn)。

3.3 AAA 形成的潛在信號(hào)通路

本研究信號(hào)通路富集結(jié)果表明，AAA 形成可能與Th1和Th2分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞凋亡、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等途徑相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在人AAA 樣本和AAA 模型動(dòng)物樣本中，Th1、Th17的數(shù)量增多，Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量下降，提示Th1/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的失衡與AAA 的形成和發(fā)展有關(guān)；IL-17主要來源于Th17細(xì)胞，參與中性粒細(xì)胞募集等免疫過程，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。氧化應(yīng)激是AAA 的主要致病因素之一，提示通過控制IL-17的合成和Th17細(xì)胞的活性來抑制氧化應(yīng)激可能是AAA的潛在治療靶點(diǎn)[20]。胡杰等[21]研究證實(shí)，黏附相關(guān)基因FKKMT2、ROCK1和LAMA5可能通過介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附作用參與AAA 形成。剪切應(yīng)力參與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成病理過程，當(dāng)動(dòng)脈管腔狹窄時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞感知到血流對(duì)管壁作用力的改變，可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶釋放，使動(dòng)脈管壁重塑、變薄，導(dǎo)致AAA 形成[22]。雌激素水平是心血管疾病的保護(hù)因素，與AAA 形成存在關(guān)聯(lián)，研究證實(shí)，女性AAA發(fā)生率低，且病情進(jìn)展緩慢[23]。另有研究證實(shí)，吸煙女性AAA 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于吸煙男性，可能與吸煙損傷了雌激素的保護(hù)作用有關(guān)[24]。

綜上所述，T細(xì)胞、B細(xì)胞在AAA樣本中占比較大，與AAA形成關(guān)系密切，Th1、Th2、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞凋亡、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等是AAA潛在的干預(yù)通路，但由于此類研究方法尚未在AAA機(jī)制探索中大范圍應(yīng)用，且樣本量較小，本研究挖掘得到的AAA潛在核心靶點(diǎn)PTPRC、CD3D、CD79B、CD3E、CD247、GAPDH、FN1、CTSD、ANXA5、CTSB與AAA的相關(guān)性有待進(jìn)一步明確。