非小細胞肺癌矮小同源盒基因2和Ras相關結構域蛋白家族1A基因甲基化的意義

張旭光, 達海麗, 邢文婷

(山西省汾陽醫(yī)院, 山西 汾陽 032200)

肺癌是世界范圍內(nèi)與癌癥相關死亡的主要原因,患者5年生存率仍不足15%,使得其成為一個嚴重的健康和經(jīng)濟問題。而肺癌大多數(shù)是在疾病的晚期被診斷出來,目前已知的治療手段療效有限,因此識別可用于早期檢測和預后評估的新生物標記尤為重要。由于表觀遺傳學改變比癌癥基因組中的基因突變更常見,通過尋找有效的表觀遺傳學生物標志物,有利于指導癌癥早期診斷[1]。表觀遺傳學改變包括DNA甲基化的變異性,報道表明,如若基因啟動子區(qū)域的CpG島受到異常甲基化的影響,則可以顯著促進腫瘤的發(fā)展[2]。異常的DNA甲基化是表觀遺傳學改變的一種常見形式,它已被證明與許多癌癥密切相關[3]。越來越多的證據(jù)表明,矮小同源盒基因2(short stature homobox 2,SHOX2)和Ras相關結構域蛋白家族1A (RAS association domain family 1A,RASSF1A)基因甲基化可作為輔助診斷肺癌的生物標志物,但仍然存在爭議,基于此,本文通過探究SHOX2和RASSF1A基因甲基化與非小細胞肺癌(NSCLC)浸潤、轉移的關系,旨在進一步分析NSCLC發(fā)生、發(fā)展的機制。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇我院2019年1月至2021年1月收治的NSCLC患者并經(jīng)手術切除的新鮮標本116例,每例分別取其癌組織及對應的癌旁正常組織,所有標本均經(jīng)病理證實為NSCLC。全部病例術前均未接受放療或者化療,所得標本切除后立即放入液氮中,置于-80℃冰箱保存,備用。所有入組研究對象中,男性69例,女性47例;年齡30～72歲,平均年齡(55.81±7.46)歲;既往有吸煙史60例,無吸煙史56例。腫瘤臨床病理TNM分期標準,Ⅰ期24例,Ⅱ期31例,Ⅲa期30例,Ⅲb期31例;有淋巴結轉移64例,無淋巴結轉移52例。

1.2方 法

1.2.1DNA提取以及亞硫酸氫鹽修飾:根據(jù)說明書,使用DNeasy組織試劑盒(德國Qiagen公司)從NSCLC癌組織和癌旁正常組織中分離基因組DNA,并使用NanoDrop 2000分光光度計進行DNA定量。根據(jù)制造商的說明,使用Epitect 96亞硫酸氫鹽試劑盒(德國Qiagen公司)對每個樣品的450ng DNA進行亞硫酸氫鹽轉化。PCR反應的最終體積為25μL,其中包含2.5μL反應緩沖液,0.5μL(10mmoL)dNTP混合物,0.2μL Fast Start Taq DNA聚合酶(1U,Roche),1μL正向和反向引物(最終濃度為10pmoL),18.8μL的無核酸酶水和1μL的亞硫酸氫鹽處理的DNA。陰性對照用水代替模板DNA進行PCR。

1.2.2甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP):使用亞硫酸氫鈉修飾的DNA在描述的條件下進行MSP,擴增程序:95℃ 15min,變性;95℃ 30s,擴增;72℃ 30s,延伸;60℃ 30s,退火;40個循環(huán),72℃ 10min。SHOX2甲基化引物:5'-GTTTTTTGTTTTTTGGTTCGG-3',5'-CTAAACAACCAAATAATCTCCGTC-3';非甲基化引物:5'-CCTCCTACCTTCTAACCC-3',5'-GTTTTTTGGATAGTTAGGTAAT-3'。RASSF1A甲基化引物:5'-GGGTTTTGCGAGAGCGCG3'和5'-GCTAACAAACGCGAACCG-3';非甲基化引物:5'-GCTAACAAACGCGAACCG-3'和5'-GCTAACAAACGCGAACCG-3'。取所得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中進行成像并且拍照,并將PCR產(chǎn)物進行酶切,在3%的瓊脂糖凝膠中進行檢測。

1.3統(tǒng)計分析:應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù),計數(shù)資料采用n(%)表示,進行χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1NSCLC癌組織和癌旁正常組織中SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情況比較:NSCLC癌組織中SHOX2和RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率分別為68.97%、33.62%,明顯高于癌旁正常組織中的12.93%、10.34%(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC癌組織和癌旁正常組織中SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情況比較[n=116,n(%)]

2.2SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情況與NSCLC臨床病理特征的關系:SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情況與NSCLC患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、分化程度無關(P>0.05),與其TNM分期、病理分型、淋巴結轉移以及患者生存時間有關(P<0.05),TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者SHOX2基因甲基化率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),鱗癌患者基因甲基化率明顯高于腺癌患者(P<0.05),有淋巴結轉移患者基因甲基化率明顯高于無淋巴結轉移患者(P<0.05),生存時間<2年患者基因甲基化率明顯高于生存時間≥2年患者(P<0.05);TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者RASSF1A基因甲基化率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),腺癌患者基因甲基化率明顯高于鱗癌患者(P<0.05),有淋巴結轉移患者基因甲基化率明顯高于無淋巴結轉移患者(P<0.05),生存時間<2年患者基因甲基化率明顯高于生存時間≥2年患者(P<0.05)。見表2。

表2 NSCLC癌組織中SHOX2和RASSF1A基因甲基化分布情況與臨床病理特征的關系n(%)

3 討 論

NSCLC由于其早期復發(fā)和廣泛的轉移潛力而成為癌癥相關死亡的主要原因。盡管已經(jīng)開發(fā)出多種診斷技術和治療方法,但是仍有大約40%的NSCLC患者是處于晚期階段被首次確診,患者5年總生存率低于18%[4]。因此,尋找與NSCLC診斷以及預后評估相關的基因并提供個體化治療具有重要意義。表觀遺傳學的變化表現(xiàn)為穩(wěn)定且可遺傳的染色質(zhì)變化,它可以在不改變DNA序列本身的情況下對基因表達產(chǎn)生影響,DNA甲基化是表觀遺傳水平上基因表達、細胞生長和細胞分化的重要調(diào)控方式。DNA甲基化主要發(fā)生在啟動子區(qū)域的C-磷酸-G(CpG)島上,大多數(shù)的DNA甲基化發(fā)生在CpG二核苷酸胞嘧啶上,異常DNA甲基化的表觀遺傳學變化在多種類型癌癥的腫瘤發(fā)生中起重要作用[5]。相關證據(jù)表明,SHOX2和RASSF1A基因的失調(diào)與NSCLC的復發(fā)和轉移有關[6]。因此,臨床上鑒定與浸潤、轉移有關的SHOX2和RASSF1A基因甲基化十分必要。

SHOX2是同源盒基因家族中的一員,也稱為OG12、OG12X或者SHOT基因,位于3號染色體長臂(3q25-q26.1.8),作為一種轉錄因子,SHOX2參與了包括肢體形成和心臟發(fā)育在內(nèi)的各種胚胎發(fā)育過程,其基因表達調(diào)控與器官發(fā)育密切相關[7]。研究發(fā)現(xiàn),SHOX2基因包括兩個大的CpG島,一個在5'端,覆蓋大約1kb的區(qū)域,另一個在3'端,覆蓋大約0.5kb[8]。SHOX2基因甲基化與肺癌等腫瘤有關,其是否有望成為腫瘤的診斷監(jiān)測指標備受學者們的關注。Darwiche等[9]研究發(fā)現(xiàn),與形態(tài)正常的鄰近組織相比,肺癌組織標本中的DNA在SHOX2基因位點甲基化程度更高,SHOX2的異常DNA甲基化已被廣泛表征為診斷肺癌的生物標志物。本次研究結果顯示,NSCLC癌組織中SHOX2基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率68.97%明顯高于癌旁正常組織中的12.93%,表明SHOX2基因啟動子區(qū)甲基化程度越高,腫瘤發(fā)生浸潤、轉移的可能性越大。同時,本次研究結果發(fā)現(xiàn),TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者基因甲基化率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者,鱗癌患者基因甲基化率明顯高于腺癌患者,有淋巴結轉移患者基因甲基化率明顯高于無淋巴結轉移患者,生存時間<2年患者基因甲基化率明顯高于生存時間≥2年患者,表明SHOX2基因的異常甲基化可能導致了SHOX2基因失活,其表達水平降低,使得其抑制腫瘤進展的能力下降。提示SHOX2基因可能作為NSCLC疾病診斷的一個特定和潛在的無創(chuàng)性生物標志物,尤其是對于鱗狀細胞癌的診斷具有良好的價值。Shumin等[10]研究也指出,SHOX2基因在鱗狀細胞癌中的甲基化率明顯高于腺癌中,甲基化的SHOX2基因可作為一種非侵入性生物標志物用于診斷肺癌,本文研究與之相符。

RASSF1A,也稱為包含RAS相關結構域的蛋白1A基因,位于染色體3q21.3,全長1873bp,包括2個啟動子和6個外顯子,其啟動子區(qū)域存在16個CpG位點[11]。RASSF1A是腫瘤中最常見的表觀遺傳失活的抑癌基因之一,當基因表達缺失或改變時,可誘導多種癌癥發(fā)生,并且其啟動子區(qū)域的高度甲基化會導致RASSF1A基因表達缺失[12]。本研究結果顯示,NSCLC癌組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生率為33.62%,明顯高于癌旁正常組織中的10.34%,與既往文獻報道結果基本一致[13]。進一步研究發(fā)現(xiàn),TNM分期中Ⅲa+Ⅲb期患者RASSF1A基因甲基化率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者,腺癌患者基因甲基化率明顯高于鱗癌患者,有淋巴結轉移患者基因甲基化率明顯高于無淋巴結轉移患者,生存時間<2年患者基因甲基化率明顯高于生存時間≥2年患者,表明RASSF1A基因啟動子甲基化在NSCLC發(fā)病機制以及疾病進展中起著重要的作用。報道指出,RASSF1A失活是Ras/PI3K/AKT、Ras/RAF/MEK/ERK以及Hippo癌癥途徑的組成部分,也是導致惡性腫瘤發(fā)病和發(fā)展的重要因素[14]。但RASSF1A基因甲基化參與NSCLC浸潤、轉移的分子機制尚需更多研究以證明。本研究的創(chuàng)新之處在于,明確了SHOX2和RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化可能是NSCLC發(fā)生浸潤以及轉移的原因之一,檢測SHOX2和RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化可為NSCLC的診斷及預后評估提供參考價值。此外,基因啟動子區(qū)的甲基化通常會引起基因表達量的變化,但本研究并未檢測SHOX2和RASSF1A基因在癌組織與癌旁組織中的表達情況,這將是后續(xù)研究工作的方向之一。

綜上所述,SHOX2和RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化可促進NSCLC發(fā)生浸潤以及轉移,為其與患者臨床特征間的相關性提供見解以及作為臨床診斷的輔助手段,對患者治療方案選擇以及預后評估提供理論參考,具有良好的應用價值。