一例牛焦蟲病急性死亡病例的檢測(cè)

余世祥，班福澤，郭紅瑞，吳紹偉，鄧成松，魯金強(qiáng)，張松梅，張曉梅，柴 俊，張以芳*

(1.德宏州尚善品味農(nóng)業(yè)有限公司 679200；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 650201)

牛焦蟲病又叫做巴貝斯蟲病或牛梨形蟲病，是一種流行性強(qiáng)且比較嚴(yán)重的寄生蟲病之一，這種疾病是牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲寄生于牛紅細(xì)胞中而引起的血液原蟲病[1]，它依靠蜱蟲進(jìn)行傳播。臨床癥狀表現(xiàn)為高熱稽留40～42 ℃、食欲減退、心跳加快、反芻緩慢、黃疸、貧血、生長(zhǎng)發(fā)育不良、身體消瘦、排血紅蛋白尿等癥狀[2]，一般情況下潛伏周期為14～20 d。同時(shí)蜱蟲在6～8月大量繁殖，所以發(fā)病高峰期也集中在這段時(shí)間，且大多呈散發(fā)或地方性流行為主[3]。焦蟲感染動(dòng)物很多，但主要危害牛、羊[4]。該牛臨床檢查時(shí)表現(xiàn)為心跳加快、高熱、呼吸急促、食欲減退，治療時(shí)用安乃近、頭孢等退燒藥治療無(wú)效后死亡，對(duì)其進(jìn)行病理解剖，發(fā)現(xiàn)牛心臟被大量脂肪包裹，血液稀薄，其余沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯病變，初步確診為先天性護(hù)心脂肪異常（脂肪心），但因血液稀薄，用安乃近、頭孢等退燒藥無(wú)效，疑似感染焦蟲病，為此我們進(jìn)行血涂片鏡檢觀察和PCR 檢測(cè)，具體檢測(cè)方法如下。

1 材料及方法

1.1 樣品

云南德宏地區(qū)某牛場(chǎng)疑似患焦蟲病急性病死?？鼓?/p>

1.2 主要試劑

瑞氏染液；核酸染料（溴化乙啶）購(gòu)自賽百盛公司；50xTAE 緩 沖 液 購(gòu) 自BIOWEST；DL2000 DNA Maker、RNasefree Water 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)、血液/細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)器械

電子天平（YP3002）購(gòu)自BIO-RAD 公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；移液槍（15599618）購(gòu)自BIO-RAD 公司；電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海比朗儀器制造有限公司；漩渦振蕩器購(gòu)自江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；電泳儀（BG-power 600）購(gòu)自北京百晶科技公司；PCR 儀購(gòu)自BIO-RAD 公司；迷你離心機(jī)（LX-200）購(gòu)自其林貝爾儀器制造有限公司；4℃離心機(jī)（1—14K 145870）購(gòu)自常州電器國(guó)華有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-lt2-310）購(gòu)自美國(guó)UVP 公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII）購(gòu)自Thermo Hybaid 公司；數(shù)碼生物顯微鏡（BM2100）購(gòu)自江南永新光學(xué)有限公司。

1.4 牛血液血涂片的制備

取一載玻片放在平坦的實(shí)驗(yàn)桌上，吸取一小滴血液于載玻片中央，右手持推片緩慢靠近血滴，停留片刻使血液向兩邊展開，充分展開后調(diào)整推片與載玻片之間的角度，使其成呈45°角，用相同的速度將血液推成血涂片，且血涂片厚薄度要適合，血涂片制好后將其徹底晾干，血液完全晾干后，用瑞氏染液進(jìn)行染色，用顯微鏡進(jìn)行觀察有沒(méi)有蟲體，如果有則進(jìn)行下一步檢測(cè)，觀察結(jié)果如圖1 所示。

圖1 焦蟲血涂片

1.5 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GeneBank 中登錄的基因序列，應(yīng)用Primer6軟件設(shè)計(jì)引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，正向引物：CTATGCCGACTAGGGATTGG；反向引物：TCCTTACGCTGTCTGGACCT。目的條帶大小為200bp。

1.6 基因組的提取

第一，取200 μL 抗凝血于1.5 mL 離心管中；

第二，加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混勻，然后加入200 μL 結(jié)合液CB，充分混勻，70℃水浴加熱10 min。

第三，冷卻至室溫加入100μL 異丙醇，充分混勻。

第四，取一吸附柱AC 放入收集管中，將上述混合物倒入其中，13000rpm 離心1 min，去掉收集管中的液體。

第五，加入500 μL 抑制物去除液IR，13000 rpm離心30 sec，去除廢液。

第六，加入600 μL 漂洗液WB，13000 rpm 離心30 s，棄除廢液，重復(fù)一次。

第七，將吸附柱AC 放入新的收集管中，13000 rpm離心2 min。

第八，取出吸附柱AC，放入一個(gè)新的離心管中，加100 μL 洗脫緩沖液EB 于吸附膜中間，靜置5 min，13000 rpm 離心1 min。

第九，提取產(chǎn)物放于-20℃保存，如需長(zhǎng)期保存則應(yīng)放置-80℃冰箱中保存。

1.7 PCR 擴(kuò)增

將PCR 管進(jìn)行高壓滅菌，向其中分別加入2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，焦蟲上游引物和下游引物各1 μL，模板DNA1μL，由于整個(gè)體系需保持25μL，所以需要加入雙蒸水9.5μL，充分混勻，然后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)35 次，循環(huán)結(jié)束后72℃孵育7 min，然后保存在4℃條件下。

1.8 瓊脂糖凝膠制備

按每10 mL 1×TAE 溶液，加1.0 g 瓊脂糖粉的比例稱量1×TAE 電泳液與瓊脂糖粉，加熱至完全溶解。

1.9 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

瓊脂糖凝膠冷卻至30℃左右時(shí)加入核酸染料，然后倒置至膠槽中等待凝固，凝固后取出膠板將膠板放入電泳槽中，添加1xTAE 電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板為止，取7 μL DL2000 DNA Marker 加入第一個(gè)上樣孔中，在另一上樣孔中加入7 μL 水作為陰性對(duì)照，然后取2 μL loading buffer 與5 μL 待測(cè)樣品充分混勻，加入另一上樣孔中。加樣時(shí)要注意不要把凝膠底部刺穿。加樣完畢后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓60～100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm 處時(shí)（一般30～60 min），關(guān)閉電源，取出膠板，使用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察，并拍照保留，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 引物擴(kuò)增結(jié)果

1.10 檢測(cè)陽(yáng)性樣品PCR 產(chǎn)物目的片段膠回收

第一，在紫外燈下快速切下凝膠中目的條帶，放入離心管，稱重。凝膠重100 mg 視為100 μL。

第二，加入3 倍凝膠體積GSB 溶液，55℃水浴10 min 融化凝膠塊，每3 min 搖晃，直至凝膠融化。

第三，將融化的凝膠溶液吸入離心柱，靜置2 min。12000 r 離心1 min，棄濾液。

第四，在離心柱中加入700 μL WB 溶液，12000 r離心1 min，棄濾液。

第五，重復(fù)步驟四。

第六，12000 r 離心2 min，除剩余WB 溶液。

第七，將離心柱置于新離心管中，在柱中心加入40 μL EB 溶液（于60℃水浴預(yù)熱），靜置5 min，12000r 離心2 min，洗脫DNA。

第八，產(chǎn)物-20℃保存。

1.11 DNA 測(cè)序及同源性分析

將回收產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血涂片瑞氏染色結(jié)果

血涂片瑞氏染色觀察，可見(jiàn)紅細(xì)胞內(nèi)有環(huán)形、梨形、橢圓形的典型蟲體，結(jié)果如圖1 所示。

2.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果

PCR 核酸鑒定檢測(cè)出與目的條帶相符條帶，如圖2所示。

2.3 PCR 產(chǎn)物序列及序列比對(duì)結(jié)果

PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如下：

TCTATGCCGACCTGGGATTGGAGGTCGTCAGTTT TTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGA-AAATCAAAGTC TTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAA CTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTG GAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACT CACCAGGTCCAGACAGCGTAAGGAAA

將該序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果顯示該基因與呂氏泰勒蟲同源性為98.97%，下圖3所示。

圖3 序列比對(duì)結(jié)果部分截圖

綜合以上，形態(tài)染色、PCR 擴(kuò)增及基因同源性比對(duì)結(jié)果，確診該發(fā)病牛的主要致病原因是血液呂氏泰勒蟲感染。

3 討論

蜱蟲也叫壁虱、扁虱、狗豆子、草爬蟲，大多生活在森林、灌木叢、草地草原、半荒漠地帶、鳥巢中，同時(shí)也常寄生于一些動(dòng)物身上[5]。焦蟲病由蜱傳播，又稱蜱熱。云南省德宏州是焦蟲病的常發(fā)地區(qū)，發(fā)病季節(jié)為每年6～10 月份。

本次檢查時(shí)間為11 月，氣溫逐漸降低，已過(guò)蜱蟲大量繁殖期，本不應(yīng)感染焦蟲病，為此我做出如下分析：第一，焦蟲病是由于攜帶病原的蜱蟲叮咬感染，德宏州屬于亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨量充沛，干濕分明，氣候溫暖，年溫差小，牛場(chǎng)所在地又靠近森林，且牛圈旁有一定數(shù)量的草地，適合蜱蟲生活，所以11 月份偶爾有蜱蟲活動(dòng)，導(dǎo)致牛只患焦蟲??；第二，蜱蟲所攜帶的焦蟲為血液寄生蟲，可造成血液攜氧氣能力下降，氧飽和度降低，加上這段時(shí)間處于換季，氣溫逐漸降低，牛只抵抗力相對(duì)減弱，在各種因素誘導(dǎo)下造成牛只心臟病發(fā)病，從而導(dǎo)致牛只死亡；第三，牛場(chǎng)養(yǎng)殖模式為圈養(yǎng)，時(shí)常有外來(lái)牛只在牛場(chǎng)周邊活動(dòng)，導(dǎo)致消毒滅蜱工作進(jìn)行不徹底，導(dǎo)致有牛只感染焦蟲病。

家畜養(yǎng)殖過(guò)程中寄生蟲病時(shí)常發(fā)生，給人們?cè)斐奢^大經(jīng)濟(jì)損失，引起了人們高度重視。同時(shí)焦蟲病又是流行性強(qiáng)且比較嚴(yán)重的寄生蟲病之一。所以在養(yǎng)殖過(guò)程中我們要做到以下幾點(diǎn)：第一，養(yǎng)殖過(guò)程中“以防為主，防治結(jié)合”搞好滅蜱工作，阻斷傳播媒介，根據(jù)蜱蟲生活習(xí)性，在蜱蟲大量繁殖季節(jié)每星期用一定比例敵殺死油乳劑對(duì)牛體、圈舍及周邊環(huán)境進(jìn)行滅蜱和清除蟲卵[6]，也可用燒牛糞、堆糞發(fā)酵等方法處理蜱蟲滋生環(huán)境；第二，加強(qiáng)免疫。引進(jìn)牛只時(shí)先隔離觀察，確認(rèn)健康后才能混養(yǎng)，嚴(yán)禁病牛入場(chǎng)，飼養(yǎng)過(guò)程中定期對(duì)牛進(jìn)行檢疫；第三，加強(qiáng)藥物預(yù)防。在焦蟲病高發(fā)季節(jié)，對(duì)牛合理使用中藥或西藥進(jìn)行預(yù)防[7]；第四，加強(qiáng)疫苗預(yù)防。每年3～4 月份對(duì)牛進(jìn)行牛焦蟲疫苗免疫接種；第五，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。做好牛圈環(huán)境衛(wèi)生清理，定期對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行消毒，殺滅蚊、蠅、蜱等寄生蟲的中間宿主[8]；加強(qiáng)牛場(chǎng)周邊管理，禁止其他動(dòng)物靠近牛場(chǎng)周邊。第六，對(duì)于放牧牛群，放牧區(qū)可以采取牧場(chǎng)輪換和牧場(chǎng)隔離的方法，切斷蜱蟲吸血來(lái)源，來(lái)年再進(jìn)行放牧，這種也是預(yù)防焦蟲病的有效方法之一，還可以在放牧前對(duì)牧區(qū)進(jìn)行藥物殺蜱，以防發(fā)病。