感冒止咳顆粒中柴胡的質(zhì)量分析研究

周鶴，章順

九江市檢驗檢測認證中心，江西 九江 332000

感冒止咳顆粒是由柴胡、黃芩、桔梗、青蒿、連翹、葛根、山銀花、苦杏仁、薄荷腦等九味中藥組成，可用于治療因外感風熱引起的咳嗽癥狀［1］。方中柴胡、山銀花疏散退熱，共同為君藥；葛根具有解肌退熱的功效，青蒿可緩解虛熱，而連翹和黃芩則可清熱解毒，共為臣藥；桔梗與苦杏仁共同發(fā)揮宣降肺氣、止咳化痰的功效，而薄荷腦芳香辛散則作為輔助藥物，與其他藥物協(xié)同作用，起到清熱解表、止咳化痰的效果。感冒止咳顆粒具有疏風宣肺，清里透表之功效，臨床上主要治療風寒表證引起的咳喘及小兒發(fā)熱惡寒等癥［2］。目前，感冒止咳顆粒的法定標準為《中國藥典》2020 年版一部，標準只規(guī)定了黃芩苷的含量測定項目。查閱相關文獻［3-6］，未有感冒止咳顆粒中君藥柴胡的含量測定方法研究。本研究建立了感冒止咳顆粒中柴胡的薄層色譜法和柴胡皂苷a 的高效液相色譜法，對13 個企業(yè)生產(chǎn)的45 批感冒止咳顆粒進行了柴胡的定性和定量分析，以便更全面地反映感冒止咳顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 HPLC 色譜儀（waters 公司）；Jp080s 型超聲機（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（Camag 公司）；AGF285 型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2 對照品

柴胡皂苷a 對照品（批號：110777-201912，含量94.8%）；柴胡皂苷d 對照品（批號：110778-201912，含量96.3%）；柴胡對照藥材（批號：120992-201509）；均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

共有13 個企業(yè)的45 批次感冒止咳顆粒樣品，其中生產(chǎn)企業(yè)A 8 批，生產(chǎn)企業(yè)B 9 批，生產(chǎn)企業(yè)C 5 批，生產(chǎn)企業(yè)D 4 批，生產(chǎn)企業(yè)E、F 各3 批，生產(chǎn)企業(yè)G、H、I、J、K、L 各2 批，生產(chǎn)企業(yè)M1 批。按感冒止咳顆粒處方制備缺柴胡陰性對照樣品。

1.4 試劑

硅膠G 薄層色譜板（德國默克公司，批號：HX90656226）；超純水；乙腈、磷酸為色譜純；對二甲氨基苯甲醛（麥克林，批號C11854367）；乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正丁醇、氨水、硫酸均為分析純。

2 柴胡薄層色譜鑒別

取樣品20 g，研細，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，加正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，棄去氨洗液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水洗液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取柴胡對照藥材約1.0 g，加甲醇25 mL，同法制成對照藥材溶液。取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 對照品適量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。取缺柴胡陰性對照樣品，同法制備陰性對照溶液。吸取上述五種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液［1］，60 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視［7-8］。

薄層色譜結果表明：供試品色譜中在與柴胡皂苷a 對照品和柴胡對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與柴胡皂苷d 對照品色譜相應的位置上，未顯相同顏色的斑點；陰性對照溶液無干擾。

3 柴胡皂苷的液相鑒別

3.1 色譜條件

Waters e2695-2424 型 HPLC 色譜-ELSD 檢測器；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（81∶19）；流速0.7 mL/min；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。ELSD 檢測器檢測參數(shù)：載氣（N2）體積流量2.38 SLPM/min，漂移管溫度90 ℃。

3.2 溶液配制

3.2.1 對照品溶液的制備稱取柴胡皂苷a 對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成含柴胡皂苷a0.387 7mg/mL 的溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備取樣品約20 g，研細，精密稱定，加甲醇50 mL 超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，加正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，棄去氨洗液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水洗液，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至2 mL 量瓶，作為供試品溶液。

3.2.3 陰性對照溶液的制備稱取缺柴胡陰性對照樣品約20 g，同“3.2.2”項下方法制備，即得。

3.3 系統(tǒng)適應性試驗和方法學考察

3.3.1 系統(tǒng)適應性試驗取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液，按“3.1”項下色譜條件進行分析，結果見圖1。

圖1 感冒止咳顆粒HPLC色譜圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液

3.3.2 線性關系考察精密吸取對照品溶液10 μL和30 μL，注入液相色譜儀測定峰面積。以進樣質(zhì)量（μg）的對數(shù)為橫坐標，以峰面積的對數(shù)為縱坐標，繪制log-log 標準曲線并進行回歸分析。結果表明：柴胡皂苷a 在3.877～11.63 μg 范圍內(nèi)，峰面積與進樣質(zhì)量呈良好的log-log 線性關系，回歸方程y=1.003 936x+5.258 356，相關系數(shù)r=0.999 9。

3.3.3 精密度試驗精密吸取對照品溶液10 μL，按“3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，結果柴胡皂苷a 峰面積的RSD 為0.5%，表明儀器精密度良好。

3.3.4 重現(xiàn)性試驗取樣品（批號：ZCB2106）6 份，各約20 g，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定，結果柴胡皂苷a 平均含量為0.052 5 mg/g，RSD 為0.8%。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、24 h 進樣測定，結果供試品溶液中柴胡皂苷a 峰面積RSD 為0.3%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.6 回收率試驗采用加樣回收試驗，取已知含量的樣品（批號：ZCB2106）6 份，各約10 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.035 7 mg/mL 的柴胡皂苷a 對照品溶液15 mL，按“3.2.2”項下方法分別制備6 份回收率供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結果平均回收率為96.8%，說明方法準確度較高。結果見表1。

表1 柴胡皂苷a回收率試驗結果

3.3.7 檢測限考察取對照品溶液用甲醇進行逐級稀釋并進樣分析，當信噪比（S/N）為3 時，柴胡皂苷a 的檢出限為0.007 mg/mL。

3.4 樣品測定

45 批樣品按上述方法進行柴胡皂苷a 的測定，計算樣品中柴胡皂苷a 含量。結果見表2。

表2 各企業(yè)樣品中柴胡皂苷a的含量測定結果 mg/g

4 討論

由于柴胡皂苷a、d 分子中環(huán)氧結構的不穩(wěn)定性，導致在生產(chǎn)工藝水煎煮過程中大量轉(zhuǎn)化成柴胡皂苷b1和b2。在本研究中，樣品的制備過程在堿性條件下提取，盡量減少柴胡皂苷a、d 的轉(zhuǎn)化。但試驗結果為柴胡皂苷d 均未檢出，柴胡皂苷a 部分被轉(zhuǎn)化，導致兩種皂苷含量的不確定性［9-10］，這也是目前眾多柴胡制劑標準未對柴胡皂苷控制的主要原因。

本研究針對13 個企業(yè)的45 批次樣品進行柴胡、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的薄層鑒別，結果所有批次樣品中均未檢出柴胡皂苷d，原因可能是在柴胡飲片煎煮加工過程中，柴胡皂苷d 易出現(xiàn)水解的現(xiàn)象，使得柴胡皂苷d 無法檢出。柴胡皂苷a 薄層色譜檢測結果與HPLC 檢測結果一致，說明所建立的薄層色譜具有較高的準確度，可以用于識別感冒止咳顆粒中的柴胡皂苷a。

根據(jù)表2 結果，共有16 個批次樣品未檢出柴胡皂苷a，檢出柴胡皂苷a 的樣品含量在0.007 3～0.052 5 mg/g 之間，最高含量和最低含量之間相差7.2倍。不同企業(yè)或同一企業(yè)不同批次樣品中柴胡皂苷a 含量差異較大，可能與藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素有關。其中企業(yè)B 生產(chǎn)的9 個批次樣品中均未檢出柴胡皂苷a，具體原因有待進一步研究，提示相關企業(yè)及監(jiān)管部門應引起重視。