基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討保和丸“異病同治”非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的分子機(jī)制?

王海坤,吳毓婷,吳 娜,蘇 丹△

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬亳州醫(yī)院,安徽亳州 236800;2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,合肥 230001)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝臟細(xì)胞內(nèi)堆積為主要臨床表現(xiàn)的病理疾病,脂肪堆積超過5%即可明確診斷。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,除酒精、肝病、藥物等因素導(dǎo)致的脂肪肝外,其他均可歸為NAFLD。近年來,NAFLD的發(fā)病率不斷攀升[1],已成為我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,但卻無良好的治療手段。功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是以持續(xù)性或反復(fù)性上腹痛、惡心噯氣、早飽等為主要臨床表現(xiàn)的功能性胃腸病[2],主要累及胃和十二指腸,無器質(zhì)性病變。FD是臨床較為常見的一種疾病,但治療效果卻不盡如人意,主要存在反復(fù)發(fā)作、緩解期短等問題。有研究表明,相較于無肝病的患者,NAFLD患者的FD發(fā)病率更高[3]。隨著NAFLD合并FD的患者數(shù)量越來越多[4],如何有效治療NAFLD和FD兩種疾病是目前臨床研究的重要目標(biāo)。

NAFLD和FD雖為兩種不同的疾病,但病機(jī)均屬肝郁脾虛型,NAFLD以肝體用失調(diào),脾虛不分清濁為主要特征[5],若肝失疏泄、克脾犯胃,脾胃功能失常,可能導(dǎo)致FD[6]。中醫(yī)認(rèn)為,肝主疏泄,脾胃主升降運(yùn)化,二者相互協(xié)調(diào)促進(jìn),同時(shí)也存在相互克制的關(guān)系,因此肝胃同病應(yīng)肝胃同治[4]。保和丸出自《丹溪心法》,常用于治療食積?，F(xiàn)代研究表明:保和丸具有一定的調(diào)血脂作用,對高脂血癥、NAFLD的治療效果良好,且對功能性消化不良治療作用明顯[7]。由于中藥成分的復(fù)雜性,保和丸治療NAFLD和FD的分子機(jī)制仍未得到闡明。本研究擬從中藥組分、靶點(diǎn)、作用途徑的系統(tǒng)性角度出發(fā),基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),探討保和丸對NAFLD和FD “異病同治”的分子機(jī)制,并利用分子對接手段,對核心成分和靶點(diǎn)的親和性進(jìn)行初步驗(yàn)證,為該藥的下一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 保和丸化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的提取

保和丸的組方包括山楂、神曲、半夏、茯苓、陳皮、連翹、萊菔子、麥芽八味中藥[8]?；赥CMSP平臺(www.old.tcmsp-e.com)獲取組方中半夏、茯苓、陳皮、連翹、萊菔子、麥芽的化學(xué)成分;中藥山楂、神曲TCMSP平臺未收錄,基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(www.organchem.csdb.cn)獲取其相應(yīng)化學(xué)成分,并基于相關(guān)文獻(xiàn)對兩味中藥的成分進(jìn)行補(bǔ)充[9-12]。將獲取的所有化學(xué)成分返回TCMSP平臺,以類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%為標(biāo)準(zhǔn)[13],篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)成分并提取對應(yīng)靶點(diǎn)。由于不同平臺的算法不同,成分靶點(diǎn)提取時(shí)TCMSP平臺與其他平臺混用有失嚴(yán)謹(jǐn),因此,本研究對從其他平臺或文獻(xiàn)檢索得到而TCMSP平臺未包含的成分予以剔除處理。運(yùn)用UniProtKB數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org)將提取的靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一為人類官方基因簡稱,并刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.2 保和丸治療NAFLD和FD的交集靶點(diǎn)的獲取

采用“non-alcoholic fatty liver disease”“functional dyspepsia”作為關(guān)鍵詞,分別檢索GeneCards(www.genecards.org)、DrugBank(go.drugbank.ca)、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、PharmGKB(www.pharmgkb.org)、OMIM(omim.org)、TTD(db.idrblab.net/ttd)數(shù)據(jù)庫,搜集NAFLD和FD疾病靶點(diǎn)基因,并去重。采用R語言(v3.6.0)的VennDiagram包將保和丸化學(xué)成分對應(yīng)靶點(diǎn)、NAFLD疾病靶點(diǎn)、FD疾病靶點(diǎn)取交集,獲得保和丸“異病同治”NAFLD和FD的交集靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的建立

將保和丸化學(xué)成分及交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中,建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。使用Network Analyer插件分析上述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的特性,篩選Closeness centrality (CC)、Degree centrality (DC)、Betweenness centrality (BC)三個(gè)參數(shù)均大于各自均值的節(jié)點(diǎn)[14],進(jìn)行2次后,獲得保和丸治療NAFLD和FD的核心成分。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的建立

將1.2項(xiàng)保和丸治療NAFLD和FD的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺(www.string-db.org),模式選擇“Multiple proteins”,種屬選擇“Homo sapiens”,置信度設(shè)為“≥0.90”,并點(diǎn)選“hide disconnected nodes”,建立PPI網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出tsv文件。將該文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件,使用CytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的特性,篩選CC、DC、BC、Network centrality (NC)、Eigenvector centrality (EC)、Local average connectivity (LAC)六個(gè)參數(shù)均大于各自均值的節(jié)點(diǎn),進(jìn)行2次后,獲得核心靶點(diǎn)。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

使用R語言(v3.6.0)的org.Hs.eg.db包,將1.2項(xiàng)交集靶點(diǎn)的名稱替換為entrez ID。使用R語言的clusterProfiler、enrichplot等包,對替換后的交集靶點(diǎn)ID進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析,閾值設(shè)定:P值及校正后的P值(q值)均<0.05。按富集數(shù)量由大到小排列,使用R語言的ggplot2包對GO功能富集分析結(jié)果前10位、KEGG通路富集分析結(jié)果前20位進(jìn)行可視化,使用pathview包對KEGG關(guān)鍵信號通路進(jìn)行可視化。

1.6 分子對接驗(yàn)證

將1.3項(xiàng)的核心成分和1.4項(xiàng)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。采用PubChem數(shù)據(jù)庫(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)逐一下載核心成分對應(yīng)化合物的2D結(jié)構(gòu),使用Chem3D軟件將結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D,計(jì)算最小自由能,對結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,獲得相應(yīng)的小分子配體(“Mol2”格式)。采用PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)逐一下載核心靶點(diǎn)對應(yīng)蛋白的3D結(jié)構(gòu),使用PyMol軟件去除結(jié)構(gòu)中的異質(zhì)分子和水分子,獲得相應(yīng)的蛋白受體(“pdb”格式)。采用AutoDock Tools軟件確定小分子配體的可扭轉(zhuǎn)鍵,并對蛋白受體進(jìn)行加氫等操作,二者均轉(zhuǎn)存為“pdbqt”格式;采用Gird模塊設(shè)置對接盒子參數(shù):Spacing (angstrom)設(shè)定為1.000,盒子大小設(shè)置為可覆蓋受體的所有活性位點(diǎn)。運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對接并統(tǒng)計(jì)結(jié)合能。結(jié)合能的大小與對接活性成反比(<0 kcal/mol:小分子配體與蛋白受體具有自發(fā)結(jié)合的活性;<-5 kcal/mol:二者具有良好的對接活性;<-7 kcal/mol:二者具有強(qiáng)烈的對接活性)[15]。運(yùn)用PyMol軟件對部分結(jié)合能較小的對接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 保和丸化學(xué)成分的篩選結(jié)果

基于TCMSP平臺及1.1項(xiàng)篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得半夏、茯苓、陳皮、連翹、萊菔子、麥芽的化學(xué)成分共77種?；诨瘜W(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫獲得山楂、神曲的原始化學(xué)成分20種,并基于相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充獲得原始成分185種,將以上205種成分返回TCMSP平臺,按1.1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。由于不同平臺的算法不同,混用有失嚴(yán)謹(jǐn),對以上205種成分中TCMSP平臺未包含的成分予以剔除處理。合并以上成分后,去重得75種,部分化學(xué)成分信息見表1。

表1 保和丸部分化學(xué)成分

2.2 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

共獲取保和丸化學(xué)成分對應(yīng)靶點(diǎn)1 362個(gè),去重后得263個(gè);獲得NAFLD疾病靶點(diǎn)1 749個(gè),FD疾病靶點(diǎn)4 128個(gè)。將三者取交集,篩選出保和丸“異病同治”NAFLD和FD的交集靶點(diǎn)基因112個(gè),見圖1。

圖1 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶點(diǎn)的Venn圖

“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果見圖2(該圖分左右兩個(gè)矩陣,左邊矩陣上的節(jié)點(diǎn)代表保和丸化學(xué)成分,節(jié)點(diǎn)上的編號為成分的TCMSP ID。餅圖顏色表示該成分的來源中藥,例:紅色表示該成分的來源中藥為半夏,各顏色對應(yīng)中藥如下:紅:半夏,藍(lán):陳皮,灰:茯苓,白:連翹,黃:麥芽,青:山楂,綠:神曲。多種顏色表示該成分為幾種中藥共有。由于萊菔子的化學(xué)成分沒有靶點(diǎn)與之產(chǎn)生直接或間接聯(lián)系,因此矩陣中未出現(xiàn)該藥。右邊矩陣代表保和丸“異病同治”NAFLD和FD的交集靶點(diǎn),節(jié)點(diǎn)的大小與成分-靶點(diǎn)相關(guān)度成正比,包含150個(gè)節(jié)點(diǎn)和355條邊,即38種化學(xué)成分與112個(gè)靶點(diǎn)之間產(chǎn)生了355種直接或間接聯(lián)系。利用Network Analyer插件篩選后,獲得參數(shù)(CC、DC、BC)均大于各自均值(0.380 1、11.00、0.020 0)的核心成分共6種,分別為:luteolin(木犀草素)、quercetin(槲皮素)、wogonin(漢黃芩素)、kaempferol(山柰酚)、naringenin(柚皮素)、nobiletin(川陳皮素)。

圖2 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

PPI網(wǎng)絡(luò)由104個(gè)節(jié)點(diǎn)和382條邊組成,采用CyoNCA插件共篩選出參數(shù)(DC、NC、BC、EC、CC、LAC)均大于各自均值(15.00、5.806 9、335.24、0.142 5、0.230 4、4.40)的核心靶點(diǎn)共8個(gè),包括腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、細(xì)胞核因子kp65蛋白(nuclear factor KP65 protein,RELA)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、人源重組蛋白(recombinant human protein,HSP90AA1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT1)、絲裂原激活蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、JUN原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、MYC原癌基因(Myc proto-oncogene,MYC),流程見圖3。

圖3 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)的篩選流程圖

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果

保和丸治療NAFLD和FD交集靶點(diǎn)的GO功能共富集到2 217個(gè)生物學(xué)過程(biological process,BP)條目,77個(gè)細(xì)胞組分(cell components,CC)條目,162個(gè)分子功能(molecular function,MF)條目。其中,BP主要涉及營養(yǎng)水平反應(yīng)(response to nutrient levels)、營養(yǎng)反應(yīng)(response to nutrient)、甾體激素反應(yīng)(response to steroid hormone)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)域(membrane region)等;MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)、蛋白酶綁定(protease binding)、甾體激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等,見圖4。

圖4 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶點(diǎn)的GO功能富集分析氣泡圖

KEGG共富集到162條通路,見圖5。富集數(shù)量排名靠前的通路主要包括脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、白介素(interleukin,IL)-17信號通路、內(nèi)分泌阻力(endocrine resistance)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信號通路等。選擇圖中與NAFLD及FD相關(guān)性較大的HIF-1信號通路進(jìn)行可視化,見圖6。

圖5 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 保和丸治療非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的HIF-1信號通路圖

2.5 分子對接結(jié)果

NAFLD與FD共有的核心靶點(diǎn)蛋白與保和丸核心活性成分的分子對接結(jié)合能情況見表2?？梢?全部結(jié)合能均<-5 kcal/mol,大部分<-7 kcal/mol,表明所有核心成分與靶點(diǎn)結(jié)合活性良好,大部分結(jié)合活性強(qiáng)烈,核心成分與靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)。這些成分和靶點(diǎn)可能是保和丸“異病同治”NAFLD與FD的主要成分和靶標(biāo)。將每個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的結(jié)合能最低的對接組合進(jìn)行可視化,由于氫鍵是促使配體與活性點(diǎn)結(jié)合的主要驅(qū)動力[16],所以同時(shí)標(biāo)出小分子與蛋白之間結(jié)合的氫鍵,見圖7。木犀草素可與ATK1蛋白(PDB id:4ekl)的活性點(diǎn)ASP-292、LYS-179、GLU-228、ALA-230形成氫鍵;木犀草素可與ESR1蛋白(PDB id:1qkt)的活性點(diǎn)LEU-387、HIS-524、GLY-521形成氫鍵;槲皮素可與HSP90AA1蛋白(PDB id:2ykj)的活性點(diǎn)TRP-162、GLN-23形成氫鍵;木犀草素可與JUN蛋白(PDB id:5fv8)的活性點(diǎn)LYS-11、ARG-28、ASN-25形成氫鍵;槲皮素可與MAPK14蛋白(PDB id:1bl6)的活性點(diǎn)LYS-53、ASP-168、PHE-169形成氫鍵;木犀草素可與MYC蛋白(PDB id:5i4z)的活性點(diǎn)GLN-60形成氫鍵;山柰酚可與RELA蛋白(PDB id:3qxy)的活性點(diǎn)HIS-252、TYR-285形成氫鍵;木犀草素可以TP53蛋白(PDB id:2vuk)的活性點(diǎn)LYS-101、GLN-100、ALA-138、SER-166、ARG-196形成氫鍵。

圖7 核心成分與靶點(diǎn)的分子對接模型圖

表2 核心成分與靶點(diǎn)的分子對接結(jié)合能情況(kcal/mol)

3 討論

保和丸方劑已被2020版《中華人民共和國藥典》收錄,主治消食、和胃、導(dǎo)滯[17]?，F(xiàn)代臨床研究表明:該方可用于胃腸、肝臟、心血管、呼吸系統(tǒng)等疾病,應(yīng)用廣泛,可化裁用于各種肝郁脾虛型疾病[7],具有鮮明的“一方多用、異病同治”的中醫(yī)特色。

本研究通過“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),篩選出木犀草素、槲皮素、漢黃芩素、山柰酚等6種保和丸核心成分。木犀草素具有較強(qiáng)的抗氧自由基作用,可降低氧化應(yīng)激,增強(qiáng)脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor,adipoR)2的表達(dá),減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的堆積,減輕NAFLD的肝損傷[18],同時(shí)也有較好的胃腸損傷保護(hù)作用[19]。槲皮素抗氧化應(yīng)激作用較強(qiáng),可抑制NAFLD疾病相關(guān)因子,減少活性氧的生成、減輕肝細(xì)胞炎癥等[20],同時(shí)可通過干預(yù)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma,Bcl-2)、p38蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)等因子水平,減輕幽門螺桿菌相關(guān)胃炎所致?lián)p傷、減少細(xì)胞凋亡[21]。漢黃芩素可通過上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)-α和AdipoR2的水平減輕NAFLD的肝損傷[22],同時(shí)具有神經(jīng)穩(wěn)定作用[23],對精神心理因素導(dǎo)致的FD有一定的療效。山柰酚可抑制核因子 (nuclear factor,NF)-κB蛋白的核轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)揮體內(nèi)抗炎活性,阻斷NAFLD的進(jìn)展[24],同時(shí)可減輕血管活性腸肽、組胺等因子介導(dǎo)的胃過敏和運(yùn)動異常[25]。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出TP53、RELA、ESR1、AKT1等8個(gè)核心靶點(diǎn)。TP53與脂肪鐵死亡調(diào)控相關(guān)[26],且是最常見的腸炎發(fā)病的基因形態(tài),可能參與FD腸炎發(fā)病[27]。RELA是NF-κB通路的重要轉(zhuǎn)錄因子,抑制NF-κB通路可減輕NAFLD肝炎癥狀,且可減輕十二指腸黏膜損傷,治療FD[28]。ESR1和ATK1均參與脂質(zhì)代謝和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而加重NAFLD;此外,十二指腸及胃竇胃底均可檢測出ESR1,提示該因子可能具有調(diào)節(jié)胃腸功能的作用;ATK1是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路的重要因子,通過作用于下游NO調(diào)節(jié)酶使NO增多,從而減弱胃腸蠕動[29]。

GO富集結(jié)果表明,保和丸可通過調(diào)控BP、CC、MF的多條路徑治療NAFLD和FD,主要涉及營養(yǎng)、甾體激素等因素。FD患者飲食狀況一般不佳,常伴有營養(yǎng)不良,且有研究顯示,各種營養(yǎng)不良狀況(包括惡性營養(yǎng)不良、微量元素缺乏、亞臨床營養(yǎng)不良等)均可誘發(fā)NAFLD[30]。許多甾體激素可通過微調(diào)脂質(zhì)合成、運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因的表達(dá),調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),這些通路的失調(diào),是NAFLD發(fā)病的重要因素[31];同時(shí),FD患者血漿皮質(zhì)醇(一種甾體激素)水平的升高,是導(dǎo)致胃腸黏膜損傷的決定性因素之一[32]。因此,保和丸可通過作用于營養(yǎng)、甾體激素等因素產(chǎn)生反應(yīng),從而治療NAFLD和FD。KEGG富集結(jié)果表明,交集靶點(diǎn)大多富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、TNF、IL-17、HIF-1等信號通路,這些通路均與NAFLD、FD具有較大的相關(guān)性。研究表明:食物中脂肪的攝入可能會誘發(fā)FD患者消化不良癥狀[33],且體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常是NAFLD發(fā)病的機(jī)制之一。TNF和IL-17均是輔助性T細(xì)胞(T helper cell,Th)17分泌的重要炎性因子,Th17通路在NAFLD疾病的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。TNF不僅可誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥與再生、壞死與凋亡[34],而且其亞型TNF-α是評價(jià)FD患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一[35],IL-17也影響著腸道環(huán)境的致病免疫應(yīng)答和抗菌能力[36]。肝臟細(xì)胞缺氧是NAFLD的基本特征之一,HIF-1是缺氧誘導(dǎo)因子,通過下調(diào)其亞型HIF-1α的表達(dá)可抑制肝臟脂肪變性[37],并可減輕消化道損傷[38-39]。分子對接結(jié)果顯示,保和丸核心成分與靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性很強(qiáng),初步驗(yàn)證了以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性。

綜上所述,保和丸中的木犀草素、槲皮素、漢黃芩素等藥效成分可通過作用于TP53、RELA、ESR1、AKT1等靶點(diǎn),調(diào)控TNF、IL-17、HIF-1等信號通路,發(fā)揮治療NAFLD和FD的藥理作用。該機(jī)制涉及的藥效成分、靶點(diǎn)及信號通路比較復(fù)雜,符合中藥“多組分、多靶點(diǎn)、多途徑”的治療機(jī)理,但仍有待進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。