基于IGF-1/SDF-1/CXCR4軸研究黑地黃丸含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖遷移的影響?

李穎穎,田增輝,趙 平,潘廣輝,葉莉瑩,張法榮△

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,濟(jì)南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250014;3.泰安市中醫(yī)院,山東泰安 271000,4.廣饒縣中醫(yī)院,山東東營 257300)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為兼具易于體外分離培養(yǎng)、造血支持、多分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌效應(yīng)等多種優(yōu)點的多能干細(xì)胞,可歸巢至受損部位通過分泌相關(guān)因子或分化為相關(guān)組織以修復(fù)損傷。多項研究表明BMSCs對急性腎損傷[1]、慢性腎臟病[2]、局灶性節(jié)段性腎小球硬化[3]、糖尿病腎病[4]、腎血管疾病[5]、狼瘡性腎炎[6]、多囊腎[7]和腎纖維化[8]等多種慢性腎臟疾病都具有巨大的潛在治療作用,成為腎臟組織修復(fù)領(lǐng)域研究熱點[9]。然而BMSCs的低歸巢率以及在局部缺血缺氧條件下的低存活率影響了其治療效果[10]。近年來中醫(yī)藥在改善BMSCs微環(huán)境并促進(jìn)其歸巢領(lǐng)域備受關(guān)注[11-12]。本課題組前期研究顯示,黑地黃丸可促進(jìn)腎衰大鼠體內(nèi)BMSCs的增殖并促進(jìn)其分泌胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)-1[13]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)IGF-1是BMSCs分泌的重要細(xì)胞因子之一,在促進(jìn)BMSCs遷移歸巢過程中發(fā)揮重要作用[14-15],IGF-1可與胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)結(jié)合后通過基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal cell-derived factor, SDF)-1/趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor type, CXCR)4軸促進(jìn)自身遷移[16-17]。因此,本實驗假設(shè)黑地黃丸可促進(jìn)BMSCs自分泌IGF-1,通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)自身遷移。本研究擬通過體外實驗觀察黑地黃丸含藥血清對BMSCs增殖、遷移的影響,探索其機(jī)制,證明黑地黃丸可以促進(jìn)BMSCs遷移,為中醫(yī)藥促進(jìn)BMSCs的歸巢及治療慢性腎臟疾病提供更多實驗依據(jù)及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性Wistar大鼠30只,6～7周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。動物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)條件為:溫度22～24 ℃,相對濕度40 %～70 %,噪聲<60分貝,照明時間L/D=12 h/12 h,自由飲食飲水。動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn),倫理編號:SDUTCM20201019002。

1.2 藥品

黑地黃丸由熟地黃、蒼術(shù)、干姜、大棗共4味藥組成,均購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥房。

1.3 試劑與儀器

黃芪甲苷(純度≥98%),貨號84687-43-3,滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司;DMEM低糖培養(yǎng)基,貨號C11885500BT,美國Gibco公司;噻唑蘭,貨號M8180,1%結(jié)晶紫染液,貨號G1062,北京索萊寶公司;Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒,貨號RAWMX-90021,成脂誘導(dǎo)分化試劑盒,貨號RAWMX-90031,廣州賽業(yè)生物公司;Anti-CD90,貨號ab33694,Anti-CD34,貨號ab81289,美國abcam公司;Anti-CD45,貨號202205,美國BioLegend公司;大鼠IGF-1 ELISA測定試劑盒,貨號jl10683,上海江萊生物公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型),貨號P0010S,上海碧云天生物公司;NVP-AEW541(IGF-1R抑制劑),貨號78617-10-4,上海陶素生化科技有限公司;IGF-1抗體,貨號9750 T,SDF-1抗體,貨號3530 s,美國CST公司;CXCR4抗體,貨號11073-2-AP,武漢三鷹公司;二抗,貨號ZB2301,北京中杉金橋公司;GAPDH,貨號A19056,武漢ABclonal公司。

HFsafe-1200LC生物安全柜,上海力康Heal Force公司;FORMASTERI-CYCLE i160倒置相差顯微鏡,日本Olympus公司;BioTek Cytation 5全波長酶標(biāo)儀,美國BioTek公司;Amersham Imager600多色熒光成像系統(tǒng)(自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析),美國GE Healthcare公司。

1.4 含藥血清制備

6～7周齡雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,隨機(jī)分為黑地黃丸(熟地黃20 g、蒼術(shù)20 g、大棗20 g、干姜3 g)組、黃芪甲苷組、空白組。成人服用黑地黃丸劑量為100 g/60 kg/d,換算成200 g大鼠為10.43 g/kg/d,以此劑量給大鼠灌胃;AS-Ⅳ根據(jù)文獻(xiàn)方法[18]以1.5 mg/kg/d給大鼠灌胃;空白組每天相同時間灌等體積0.9%生理鹽水。每天灌胃1次,連續(xù)灌胃10 d,于最后一次灌胃2 h后,腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠,腹主動脈取血。室溫靜置2 h,4 ℃ 3 000 r/min離心20 min,分離血清,同組血清混合,56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體,0.22 μm濾器過濾除菌后分裝,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BMSCs原代提取與鑒定

1.5.1 BMSCs提取與培養(yǎng) 采用全骨髓細(xì)胞貼壁篩選法提取原代細(xì)胞[19]。大鼠引頸處死后,75%酒精浸泡5 min,無菌條件下取出股骨、脛骨,剪去兩端骨骺,暴露骨髓腔。完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至骨頭發(fā)白,反復(fù)吹打骨髓沖洗液,收集后室溫下1 000 r/min離心3 min,棄上清,向沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液,制成單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng),待細(xì)胞融合至80%～90%時,按照1:2傳代培養(yǎng)。

1.5.2 BMSCs鑒定

1.5.2.1 誘導(dǎo)成骨、成脂分化 取生長融合至80%～90%的P3代BMSCs,按照成骨誘導(dǎo)試劑盒說明進(jìn)行成骨誘導(dǎo),待出現(xiàn)大量明顯鈣結(jié)節(jié)后進(jìn)行茜素紅染色。倒置顯微鏡下觀察染色效果并拍照。取生長融合至80%～90%的P3代BMSCs,按照成脂誘導(dǎo)試劑盒說明進(jìn)行成脂誘導(dǎo),當(dāng)出現(xiàn)足量、大小適宜的脂滴時進(jìn)行油紅O染色。倒置顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.5.2.2 流式鑒定BMSCs表面抗原CD90、CD45、CD34的表達(dá) 取生長融合至80%的P3代BMSCs,胰酶消化后制成1×106個/mL單細(xì)胞懸液,分為陰性對照組、CD90組、CD45組、CD34組,每組各100 μL。CD90組加入1.25 μL CD90-PE染液,CD45組加入0.5 μL CD45-FITC染液,CD34組加入0.5 μL CD34-FITC染液,吹打混勻后室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測。以CD45、CD34陽性率低于5%,CD90陽性率高于95%為標(biāo)準(zhǔn)[20-23],鑒定所得細(xì)胞為高純度的BMSCs。

1.6 MTT檢測黑地黃丸含藥血清對BMSCs增殖的影響

取生長融合至80%～90%的P3代BMSCs,分為對照組、黑地黃丸含藥血清組(1%、5%、10%、15%、20%)及黃芪甲苷含藥血清組(1%、5%、10%、15%、20%),每組3個復(fù)孔,黑地黃丸含藥血清組、黃芪甲苷含藥血清組每孔分別加入100 μL含相應(yīng)濃度含藥血清的培養(yǎng)液,對照組加入含空白含藥血清的培養(yǎng)液。48 h后加入20% 噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液,37 ℃避光孵育3 h,棄液后加入150 μL DMSO溶液,酶標(biāo)儀檢測495 nm處吸光度(A)。增殖率計算公式:[(藥物組平均吸光度—對照組平均吸光度)/對照組平均吸光度×100%]。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗檢測黑地黃丸含藥血清對BMSCs劃痕愈合的影響

取生長融合至80%～90%的P3代BMSCs,以2×104個/(cm2)接種于6孔板,靜置培養(yǎng)48 h,細(xì)胞生長融合至90%時,用200 μL槍頭進(jìn)行劃痕。設(shè)置對照組、5%黑地黃丸含藥血清組、5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組(10 μg/ml)、5%黃芪甲苷含藥血清組。分別于給藥0 h、24 h于倒置顯微鏡下觀察劃痕情況并拍照,利用Image J軟件計算各組劃痕面積。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.8 Transwell法檢測黑地黃丸含藥血清對BMSCs遷移數(shù)量的影響

取生長融合至80%～90%的P3代BMSCs制備細(xì)胞懸液,以2×104個/cm2接種于Transwell小室中,將小室置于6孔板中靜置培養(yǎng)6 h。設(shè)置對照組、5%黑地黃丸含藥血清組、5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組(10 μg/ml)、5%黃芪甲苷含藥血清組。各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液,對照組加入含5%空白含藥血清的培養(yǎng)液,干預(yù)48 h后,取出小室,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,棄液,4%多聚甲醛中室溫固定15 min,PBS洗滌3次,棄液,1%結(jié)晶紫染液室溫避光染色20 min,PBS洗去浮色,用濕棉棒輕輕擦去小室上層未穿膜的細(xì)胞,將小室正置于載玻片上,于倒置顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)量并拍照。利用Image J軟件計算各組遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.9 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)IGF-1的含量

取生長融合至80%的P3代BMSCs,胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液,以2×104個/cm2接種于6孔板,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、5%黑地黃丸含藥血清組、5%黃芪甲苷含藥血清組,每組3個復(fù)孔。各給藥組分別加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)液,對照組加入含5%空白含藥血清的培養(yǎng)液,干預(yù)48 h后,取各組培養(yǎng)上清液,2 000 r/min離心20 min,取上清,按照ELISA說明書制備樣品,于酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A)。

1.10 Western blot法檢測BMSCs中IGF-1、SDF-1、CXCR4的表達(dá)

細(xì)胞接種培養(yǎng)方法同1.8。設(shè)置對照組、5%黑地黃丸含藥血清組、5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組,每組3個復(fù)孔。藥物干預(yù)48 h后,將BMSCs消化收集,加入細(xì)胞裂解液充分裂解,提取蛋白并檢測蛋白含量,取等質(zhì)量等體積蛋白樣品,進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,依次加入一抗、二抗孵育,洗膜后膠片分析儀對蛋白條帶進(jìn)行處理分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)及鑒定

圖1A示,BMSCs分離后貼壁生長,呈成纖維狀、短梭狀或不規(guī)則狀,形態(tài)欠統(tǒng)一;圖1B示,P3代BMSCs呈成纖維狀,旋渦狀緊密排列,細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)一。圖2A示,經(jīng)成骨誘導(dǎo)14 d、茜素紅染色后呈現(xiàn)大量紅色鈣結(jié)節(jié);圖2B示,經(jīng)成脂誘導(dǎo)16 d、油紅O染色后出現(xiàn)橘紅色脂滴。提取的BMSCs的細(xì)胞形態(tài)及分化能力符合干細(xì)胞特性。流式結(jié)果示,CD45、CD34陽性率低于5%,CD90陽性率高于95%,符合BMSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)(圖3)。提示所提取的原代細(xì)胞為高純度BMSCs。

注:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)A.P0代BMSCs貼壁后的細(xì)胞形態(tài);B. P3代BMSCs貼壁后的細(xì)胞形態(tài)

注:CD90陽性率為97.25%,CD45陽性率為2.22%,CD34陽性率為1.69%;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)

2.2 黑地黃丸含藥血清對BMSCs的促增殖作用

圖4示,黑地黃丸含藥血清濃度在1%～10%范圍內(nèi)可促進(jìn)BMSCs的增殖,5%黑地黃丸含藥血清對BMSCs的促增殖作用最強(qiáng),黃芪甲苷含藥血清干預(yù)濃度不超過5%時,均可促進(jìn)BMSCs的增殖,因此最終選用5%作為黑地黃丸含藥血清、黃芪甲苷含藥血清的共同干預(yù)濃度。

注:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)

2.3 5%黑地黃丸含藥血清促進(jìn)BMSCs劃痕愈合

表1、圖5示,與對照組比較,5%黑地黃丸含藥血清可顯著促進(jìn)劃痕愈合(P<0.01),提示5%黑地黃丸含藥血清可促進(jìn)BMSCs遷移。與5%黑地黃丸含藥血清組比較,5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組組劃痕愈合率顯著下降(P<0.05),證明IGF-1R抑制劑可抑制黑地黃丸含藥血清對BMSCs的促遷移作用,提示黑地黃丸含藥血清可能通過調(diào)節(jié)IGF-1信號傳導(dǎo)促進(jìn)BMSCs的遷移。

表1 5%黑地黃丸含藥血清對BMSCs劃痕愈合的影響

注:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R)

2.4 5%黑地黃丸含藥血清增加BMSCs的細(xì)胞遷移數(shù)量

表2、圖6示,與對照組比較,5%黑地黃丸含藥血清組BMSCs遷移數(shù)量顯著增加(P<0.05);與5%黃芪甲苷含藥血清組比較,5%黑地黃丸含藥血清在促進(jìn)BMSCs遷移方面更具優(yōu)勢(P<0.05);與5%黑地黃丸含藥血清組比較,5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組BMSCs遷移數(shù)量顯著減少(P<0.05),證明IGF-1R抑制劑可抑制黑地黃丸含藥血清對BMSCs的促遷移作用,提示黑地黃丸含藥血清可能通過調(diào)節(jié)IGF-1信號傳導(dǎo)促進(jìn)BMSCs的遷移。

表2 5%黑地黃丸含藥血清對BMSCs遷移數(shù)量的影響

注:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R)

2.5 5%黑地黃丸含藥血清促進(jìn)BMSCs分泌IGF-1。

表3示,與對照組比較,5%黑地黃丸含藥血清可顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中IGF-1的含量(P<0.05),且效果優(yōu)于5%黃芪甲苷含藥血清(P<0.05)。

表3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IGF-1的含量

2.6 5%黑地黃丸含藥血清影響B(tài)MSCs中IGF-1、SDF-1、CXCR4的蛋白表達(dá)。

表4、圖7示,與對照組比較,5%黑地黃丸含藥血清、5%黃芪甲苷含藥血清可顯著上調(diào)BMSCs中IGF-1的表達(dá)(P<0.05),同時使BMSCs表面趨化因子CXCR4高表達(dá)(P<0.05),并下調(diào)BMSCs中SDF-1的表達(dá)(P<0.05);與5%黑地黃丸含藥血清組比較,5%黑地黃丸含藥血清+IGF-1R抑制劑組CXCR4的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),SDF-1的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。提示黑地黃丸含藥血清也可通過增加BMSCs內(nèi)IGF-1的水平,促進(jìn)IGF-1與IGF-1R的結(jié)合,增加其表面趨化因子CXCR4的表達(dá),通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)BMSCs的遷移。

表4 5%黑地黃丸含藥血清對BMSCs細(xì)胞內(nèi)IGF-1、SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)的影響

注:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);胰島素樣生長1因子受體(IGF-1R);趨化因子(CXCR4)受體4;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1);胰島素樣生長因子-1(IGF-1)

3 討論

近年來中國成人慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患病率高[24],對其治療目前尚缺乏行之有效的方法,腎臟替代療法作為慢性腎衰竭階段的主要治療手段,雖可替代維持基礎(chǔ)腎功能,但其療效并不令人十分滿意。因此腎臟本身的修復(fù)是治療慢性腎臟疾病需重點關(guān)注的問題。BMSCs是一種多能干細(xì)胞,具有強(qiáng)大的自我更新能力、多向分化潛能以及免疫調(diào)節(jié)功能,并可分泌細(xì)胞因子、生長因子、抗氧化劑和促血管生成因子,以及刺激細(xì)胞增殖和血管生成、降低應(yīng)激反應(yīng)和受損細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)局部和全身炎癥和免疫反應(yīng)的分子,有助于組織的修復(fù)[25-26]。因此BMSCs一度成為腎臟組織修復(fù)領(lǐng)域研究熱點。目前BMSCs修復(fù)腎臟的途徑可以概括為以下3點:(1)直接分化為腎臟受損細(xì)胞,修復(fù)受損腎組織,但這種途徑目前存在極大爭議。(2)BMSCs自分泌或旁分泌相關(guān)分子修復(fù)腎損傷:包括細(xì)胞因子、生長因子、抗氧化劑等。(3)BMSCs衍生的外泌體修復(fù)腎損傷。但無論何種途徑,BMSCs順利歸巢至受損部位是BMSCs修復(fù)腎損傷的重要條件。

細(xì)胞表面關(guān)鍵受體數(shù)量不足可能是導(dǎo)致BMSCs無法有效歸巢到目標(biāo)組織的原因[27]。細(xì)胞表面趨化因子CXCR4是SDF-1的特異性受體,SDF-1與細(xì)胞表面CXCR4受體結(jié)合是參與BMSCs遷移歸巢的主要信號通路[28]。IGF-1不但可以增加BMSCs細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)水平,還顯著增加BMSCs對SDF-1的遷移反應(yīng)[27]。用IGF-1預(yù)處理BMSCs可使其凋亡減少,并提高其遷移能力[17]。此外,黃芪甲苷已被國內(nèi)外多項研究證實可改善腎功能[29],且可促進(jìn)BMSCs分泌IGF-1[30],促進(jìn)BMSCs遷移[31],故用作本研究的陽性對照藥物。黑地黃丸出自《素問病機(jī)氣宜保命集》,是補(bǔ)腎瀉濁類的經(jīng)典中藥復(fù)方。課題組前期臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),黑地黃丸可通過改善微炎癥狀態(tài)、降脂、改善腎性貧血、調(diào)節(jié)胃腸激素紊亂等多種途徑[13,32-35]改善腎功能[36]。進(jìn)一步研究顯示該方可促進(jìn)腎衰大鼠體內(nèi)BMSCs的增殖,同時還可提高其分泌IGF-1的水平[13]。

基于以上前期基礎(chǔ),本研究結(jié)果進(jìn)一步表明,黑地黃丸含藥血清可增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中及BMSCs內(nèi)IGF-1的水平,同時可上調(diào)BMSCs內(nèi)SDF-1的特異性受體CXCR4的表達(dá),下調(diào)SDF-1的表達(dá),進(jìn)而從劃痕愈合率和遷移數(shù)量兩個維度促進(jìn)BMSCs遷移。IGF-1R抑制劑NVP-AEW541可阻斷黑地黃丸含藥血清對BMSCs中CXCR4、SDF-1蛋白表達(dá)的調(diào)控,進(jìn)而阻斷BMSCs的遷移。證明了黑地黃丸含藥血清是通過促進(jìn)IGF-1與IGF-1R的結(jié)合,增加BMSCs表面趨化因子CXCR4的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控SDF-1/CXCR4軸,促進(jìn)BMSCs遷移。本研究從體外細(xì)胞實驗層面首次證明了黑地黃丸可促進(jìn)BMSCs的遷移,并初步探索了黑地黃丸促進(jìn)BMSCs遷移的可能機(jī)制。本課題組將進(jìn)一步探索黑地黃丸促進(jìn)BMSCs歸巢的機(jī)制及靶點,為中醫(yī)藥治療慢性腎臟病提供更多靶點和研究思路。