舒筋健腰丸干預(yù)TGF-β1/Smad通路抑制大鼠黃韌帶纖維化的研究?

馮 蓬,李路廣,李建國,高春雨,高景華△,劉海英

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院,北京 100102;2. 廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司,廣州 510288)

腰椎管狹窄癥普遍存在于老年人群,主要癥狀表現(xiàn)為長期腰痛、腿痛以及間歇性跛行,是脊柱手術(shù)的主要原因之一[1]。黃韌帶肥厚是導(dǎo)致腰椎管狹窄癥的常見病因,組織學(xué)上已證實黃韌帶肥厚的本質(zhì)病理改變?yōu)槔w維化[2]。在解剖層面,黃韌帶是脊柱后柱的重要組成部分,具有維持脊柱穩(wěn)定性和限制脊柱前屈的作用,椎體失穩(wěn)或過度前屈會造成黃韌帶微損傷,繼而引發(fā)炎癥反應(yīng)和繼發(fā)纖維化[3]。正常的黃韌帶是由彈性蛋白(80%)和膠原蛋白(20%)組成的彈性致密結(jié)構(gòu)[4],而纖維化黃韌帶則表現(xiàn)為膠原蛋白增多、堆積,彈性蛋白扭曲、減少和變形,膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)增大,細(xì)胞外基質(zhì)沉積、重塑[5]。黃韌帶纖維化是動態(tài)變化、逐漸累積的病理過程,具有一定的可塑性[6]。

組織纖維化和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)β1被認(rèn)為是二者的關(guān)鍵介質(zhì),其可以通過激活下游的Smad信號通路介導(dǎo)組織纖維化和激發(fā)炎癥反應(yīng)[8-9]。以往研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1/Smad通路在韌帶、腎、肝、肺、子宮和心臟等諸多器官的纖維化中均發(fā)揮著重要作用[8,10-13]。一方面,TGF-β1/Smad通路的激活能夠促進(jìn)纖維化的發(fā)生;另一方面,該通路的激活也能夠激發(fā)炎癥反應(yīng),引發(fā)疼痛刺激。在前期基礎(chǔ)研究中,研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)TGF-β1在人和大鼠纖維化黃韌帶中顯著高表達(dá)[14]。

近年來中藥的抗纖維化作用逐漸受到關(guān)注[15-16]。舒筋健腰丸是自主研制的純中藥復(fù)方制劑,具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)除濕、活絡(luò)止痛的功效。多組隨機(jī)對照臨床試驗表明舒筋健腰丸治療腰椎管狹窄癥(黃韌帶肥厚型)具有良好的療效,同時研究團(tuán)隊成功開展了前瞻性、大樣本、多中心的真實世界安全性評價[17]。臨床研究表明,舒筋健腰丸可顯著緩解腰椎管狹窄癥患者的腰痛和間歇性跛行癥狀,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此,本研究從黃韌帶TGF-β1/Smad通路方面探討舒筋健腰丸干預(yù)黃韌帶纖維化的機(jī)制,為舒筋健腰丸的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本實驗方案經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn),編號:BJLongan-L-L-003。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20)g,購于中國食品藥品鑒定研究院(北京大興),動物許可證號:SCXK(京)2017-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動物房,飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)良好,溫度20～25 ℃,濕度40%～50%,光照12 h與黑暗12 h交替循環(huán),動物自由攝食、攝水。

1.2 主要試劑和儀器

舒筋健腰丸購自廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司,國藥準(zhǔn)字Z44021058,規(guī)格120 g/瓶;Masson三色染色液、RNA提取液購自武漢塞維爾生物科技有限公司,貨號分別為G1006、G3013;兔抗大鼠Smad2/3、Smad4、Smad7、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)、山羊抗大鼠二抗亦從武漢塞維爾生物科技有限公司購入,貨號分別為GB111844、GB11174、GB13542、GB114197、GB111629、GB23302;兔抗大鼠TGF-β1由艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司提供,貨號PA2154S。

204型打磨機(jī)磨鉆,韓國世新精密工業(yè)社;RM2235型石蠟切片機(jī),德國徠卡公司;KZ-Ⅲ-F型高速低溫組織研磨儀,武漢塞維爾生物科技有限公司;CFX型熒光定量PCR儀,美國伯樂Bio-rad公司;小動物活體能譜CT系統(tǒng),中國科學(xué)院高能物理研究所。

2 方法

2.1 分組與造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將大鼠分成5組,正常組、模型組、假手術(shù)組、舒筋健腰丸低劑量組和高劑量組,每組8只。模型組、低劑量組和高劑量組均采用研究團(tuán)隊前期建立的失穩(wěn)法黃韌帶纖維化大鼠模型。造模方法為:完全切除大鼠L5和L6棘突,磨削雙側(cè)L5～L6小關(guān)節(jié),切除整個L5～L6椎旁肌,直至椎板暴露,術(shù)后3 d注射頭孢呋辛鈉給予抗感染處理,8周后全部處死用于模型評價和進(jìn)一步實驗。假手術(shù)組大鼠予假手術(shù)處理。模型評價方法:黃韌帶CVF大于30%為成模標(biāo)準(zhǔn),能譜Micro-CT作為輔助評價標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 給藥方法

實驗所用舒筋健腰丸為濃縮水蜜丸。根據(jù)廠家提供的舒筋健腰丸質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),所有丸劑分批次每日晨時經(jīng)過4 ℃、24 h蒸餾水密封浸泡,后經(jīng)充分?jǐn)嚢?制成含藥濃度為0.05 g/mL的混懸液,隨后裝于藥用高密度聚乙烯密封瓶中并做好標(biāo)記。為保證混懸液穩(wěn)定性,所有藥液均提前24 h配置并只用于第2天大鼠灌胃。按照人與大鼠體表面積換算公式計算舒筋健腰丸的大鼠給藥劑量,低劑量組以1.5 mL/100 g體積灌胃,高劑量組以3 mL/100 g體積灌胃,分別相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的0.5倍和1倍。造模3 d后即開始按計劃給藥(預(yù)防性給藥策略)。每日晨時經(jīng)專人灌胃給藥,大鼠每周按照體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。正常組、模型組、假手術(shù)組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液,每日1次,持續(xù)8周。

2.3 處死與取材

在大鼠麻醉狀態(tài)下,首先利用能譜Micro-CT(高組織分辨率45 μm)掃描大鼠腰椎黃韌帶。獲取影像學(xué)資料后,過量麻醉處死大鼠,取隨機(jī)一側(cè)大鼠L5～L6腰椎節(jié)段黃韌帶置于勻漿管中,用于后續(xù)熒光定量PCR實驗,取另一側(cè)大鼠L5～L6對應(yīng)黃韌帶腰椎節(jié)段制作病理組織切片,用于后續(xù)免疫組化實驗。

2.4 熒光定量PCR

取出放置各組大鼠黃韌帶組織的勻漿管,Trizol法提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的cDNA,配置稱20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。引物信息見表1。

2.5 免疫組化染色

依據(jù)課題組前期實驗方法,將剩余的大鼠 L5～L6腰椎組織固定、脫鈣、切開、脫水、包埋和切片,切片厚度為4 μm[14]。采用免疫組化法檢測各組大鼠黃韌帶TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Smad7、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)和定位。一抗稀釋倍數(shù)均為1:1 000,二抗稀釋倍數(shù)為1:200。采用專業(yè)圖像分析系統(tǒng) Image J 1.50進(jìn)行分析,以平均光密度值(mean optical density,MOD)作為陽性表達(dá)強(qiáng)度的評價參數(shù)。在200倍鏡視野下,每張切片隨機(jī)拍攝 3個視野,取平均值作為每張切片的觀察結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠黃韌帶纖維化評估結(jié)果

圖1示,與造模前比較,能譜Micro-CT影像顯示造模后對應(yīng)層面黃韌帶區(qū)域椎板間可見軟組織填充增多并伴隨不規(guī)則、混雜信號影,硬膜囊未見明顯受壓。與正常組比較,模型組大鼠黃韌帶膠原纖維顯著增多,“彈性-膠原”纖維比值明顯降低,CVF顯著升高(P<0.05),彈性纖維扭曲、堆積;與模型組比較,高劑量組大鼠黃韌帶膠原纖維含量明顯降低,膠原纖維扭曲、堆積、斷裂現(xiàn)象明顯減少,CVF顯著下降(P<0.05),但CVF數(shù)值仍高于20%;模型組與低劑量組比較CVF差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注:A～B分別為活體能譜Micro-CT造模前和造模后的典型CT影像圖片(L5～L6層面),比例尺=3000 μm,紅色虛框代表增生的黃韌帶區(qū)域;C～G分別為正常組、假手術(shù)組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠腰椎L5～L6層面黃韌帶Masson染色,比例尺=20 μm;H.各組大鼠腰椎L5～L6黃韌帶Masson染色CVF結(jié)果統(tǒng)計分析;與正常組比較*P<0.05;與模型組比較?P<0.05

3.2 各組大鼠免疫組化染色結(jié)果

圖2A示,各組染色圖片中TGF-β1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ陽性染色均位于細(xì)胞外基質(zhì),呈彌散樣定位;Smad2/3、Smad4和Smad7的定位相對集中,主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。圖2B示,統(tǒng)計分析結(jié)果表明,與正常組比較,模型組大鼠黃韌帶組織中TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)明顯增加(P<0.05),Smad7表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組比較,高劑量組大鼠黃韌帶組織中TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達(dá)顯著降低(P<0.05),Smad7表達(dá)明顯增加(P<0.05);低劑量組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注:轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1),Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ),Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ);與正常組比較*P<0.05;與模型組比較?P<0.05;A．各組大鼠黃韌帶中TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ免疫組化染色圖(×200);B.黃韌帶免疫組化結(jié)果統(tǒng)計分析柱狀圖(每張切片隨機(jī)選取3個視野,n=8,)

3.3 各組大鼠熒光定量PCR檢測結(jié)果

表2顯示,與正常組比較,模型組大鼠黃韌帶組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01),Smad7 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,高劑量組大鼠黃韌帶組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),Smad7 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01);低劑量組與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠黃韌帶中TGF-β1/Smad通路相關(guān)mRNA表達(dá)比較

4 討論

中醫(yī)典籍中并沒有關(guān)于腰椎管狹窄癥和黃韌帶肥厚的論述,但根據(jù)發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)可將其歸為“腰痛病”“痹證”和“腰腿痛”的范疇。黃韌帶肥厚的患者更多見于老年人,若以臟腑論治,該疾病應(yīng)以肝腎虧虛為本,風(fēng)、寒、濕邪侵襲為標(biāo),痰濕、瘀血為主要病理產(chǎn)物。因此,治療本病應(yīng)當(dāng)在祛風(fēng)、除濕、散寒的基礎(chǔ)上,對肝腎加以固護(hù),補(bǔ)瀉兼施,以通為用,扶正以祛邪,最終達(dá)到化濕、行瘀的功效。舒筋健腰丸由狗脊、金櫻子、雞血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女貞子(蒸)、桑寄生(蒸)、菟絲子(鹽制)、延胡索(制)、兩面針、乳香(制)、沒藥(制)組成。從方藥組成來看,該方標(biāo)本兼治、配伍嚴(yán)謹(jǐn),具補(bǔ)益肝腎、行氣化瘀、祛風(fēng)散寒之功。正如《證治匯補(bǔ)》中記載“治惟補(bǔ)腎為先……標(biāo)急則治標(biāo),本急則治本,初痛宜疏邪滯,理經(jīng)髓,久痛宜補(bǔ)真氣,養(yǎng)血氣”。課題組前期研究表明,舒筋健腰丸能夠有效緩解腰痛,并且能夠顯著抑制血清中的炎癥因子表達(dá)[18-19]。然而,該方對炎癥反應(yīng)和纖維化的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此,研究團(tuán)隊選用大鼠黃韌帶纖維化模型,旨在觀察舒筋健腰丸對黃韌帶纖維化進(jìn)展的抑制作用,并探討該藥對TGF-β1/Smad通路的調(diào)控作用。

從本研究中Masson染色和免疫組化結(jié)果可以看出,高劑量舒筋健腰丸可以顯著抑制大鼠黃韌帶中Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá),顯著增加黃韌帶CVF,抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的無序堆積,對持續(xù)微損傷的黃韌帶具有一定的保護(hù)作用。TGF-β1/Smad通路在纖維化過程中具有重要作用,該通路的激活與下游Smad蛋白家族有關(guān)。其中Smad2、Smad3和Smad4可形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體而核轉(zhuǎn)位,促進(jìn)TGF-β1產(chǎn)生,而Smad7屬于抑制型Smad,能夠通過阻止上述轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體核轉(zhuǎn)位等多種途徑抑制TGF-β1分泌[20]。本研究結(jié)果顯示高劑量舒筋健腰丸能夠顯著抑制大鼠黃韌帶中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4蛋白和mRNA表達(dá),增加smad7蛋白和mRNA表達(dá),發(fā)揮對黃韌帶中TGF-β1/Smad通路的抑制作用。同時,本次實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)舒筋健腰丸的作用具有劑量依賴性,低劑量可能不具備減少黃韌帶病理產(chǎn)物堆積與抑制TGF-β1/Smad通路活性的能力;而高劑量舒筋健腰丸仍不能將黃韌帶CVF和TGF-β1/Smad通路相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平恢復(fù)至正常,這表明舒筋健腰丸可能無法阻止或者逆轉(zhuǎn)黃韌帶纖維化進(jìn)程。

綜上所述,使用人等效劑量的舒筋健腰丸能夠顯著抑制模型大鼠的黃韌帶纖維化進(jìn)展,抑制大鼠纖維化黃韌帶病理產(chǎn)物的堆積,顯著抑制大鼠黃韌帶中TGF-β1/Smad通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。本研究為臨床應(yīng)用舒筋健腰丸干預(yù)黃韌帶肥厚型腰椎管狹窄癥提供了實驗依據(jù)。