不同采收時間野生酸棗與野生撫育酸棗各部位化學(xué)成分含量變化研究

陳佳昕 ，史鑫波 ，唐志書， ，宋忠興 ，王磊 ，李國龍 ，李寶劍 ，劉紅波

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 咸陽 712083；2.中國中醫(yī)科學(xué)院研究生院，北京 100700； 3.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130000

酸棗Ziziphus jujubaMill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 為鼠李科棗屬野生灌木或小喬木[1]，原產(chǎn)于我國，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱“棘”，俗稱野棗、山棗、角針、五眼果等[2]，是國家公布的第一批藥食同源品種（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51號）。酸棗主要分布于河北、陜西、山西、河南等地，多生長于干旱的低山丘陵地區(qū)[3-5]，既是干旱山地重要的生態(tài)樹種，也是綠化荒山的理想樹種和棗的優(yōu)良砧木[6]，其葉、果肉、種仁、根等均有很高的利用價值[7-10]。酸棗仁為臨床常用的安神類中藥。目前，睡眠障礙已成為嚴(yán)重的社會和民生問題，酸棗仁鎮(zhèn)靜安神和緩解失眠療效顯著[11]，市場需求逐年增長。但長期以來，酸棗資源主要來源于野生，野生酸棗資源開發(fā)利用存在較多問題。野生酸棗種質(zhì)資源混雜、缺乏優(yōu)良品種；豐產(chǎn)性差，品質(zhì)均一性無法保障；生長環(huán)境差，導(dǎo)致其掛果率低，產(chǎn)量小。人工采摘難度較大，搶青采摘及毀樹式的采收方式使野生酸棗資源儲量嚴(yán)重萎縮[12-13]，科學(xué)推廣酸棗人工種植是行業(yè)發(fā)展必然趨勢。

中藥材野生撫育是根據(jù)動植物藥材生長特性及對生態(tài)環(huán)境條件的要求，在其原生或相類似的環(huán)境中，人為或自然增加居群內(nèi)個體數(shù)量，使其資源量達(dá)到能為人們采集利用的生產(chǎn)方式[14]。根據(jù)酸棗耐旱、耐寒、耐堿等生長習(xí)性[15]，采用野生撫育技術(shù)提升酸棗資源品質(zhì)，是推動酸棗產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的有效途徑，但野生撫育酸棗與野生酸棗在有效成分含量上是否存在差異尚缺乏研究。本研究比較不同采收時間野生與野生撫育酸棗中各部位有效成分含量，為野生撫育酸棗的有效性及可推廣性提供依據(jù)，為酸棗資源保護(hù)和充分利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，連接紫外檢測器（DAD）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），美國安捷倫科技有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Sartorius CPA225D十萬分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

斯皮諾素（純度≥98%，批號111869-201203），中國食品藥品檢定研究院；6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素（純度≥98%，批號P04J12S136476）、酸棗仁皂苷A（純度≥98%，批號P08A8F33617）、酸棗仁皂苷B（純度≥98%，批號A19GB158349）、酸棗仁皂苷D（純度≥98%，批號A28HB181012），上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，Honeywell；超純水，自制。

酸棗不同部位樣品采收時間為2022年5-10月，野生撫育酸棗采自陜西省咸陽市淳化縣仲山山區(qū)酸棗野生撫育基地，野生酸棗采自陜西咸陽淳化縣仲山山區(qū)。經(jīng)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心宋忠興主任藥師鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的葉、果肉、種仁。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

取對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成分別含斯皮諾素217.80 μg/mL、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素208.80 μg/mL、酸棗仁皂苷A 261.40 μg/mL、酸棗仁皂苷B 180.36 μg/mL、酸棗仁皂苷D 154.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

將酸棗葉、酸棗果肉及酸棗仁樣品置于烘箱中，60 ℃進(jìn)行干燥處理，取干燥后的各樣品適量，粉碎（過四號篩），稱取樣品粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取1 h，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.22 μm有機(jī)濾膜，即得。

2.2 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（B）-水（A），梯度洗脫（0～20 min，10%～32%B；20～40 min，32%～44%B；40～50 min，44%～60%B；50～55 min，60%～10%B；55～65 min，10%～10%B），DAD/ELSD 串聯(lián)檢測，柱溫30 °C，檢測波長335 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。ELSD參數(shù)：增益105 ℃，漂移管溫度 70 ℃，氣壓0.7 MPa。按上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分的分離度良好，對照品和供試品HPLC圖見圖1。

圖1 酸棗仁對照品和供試品HPLC-DAD/ELSD圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，稀釋成系列濃度梯度的混合對照品溶液，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、對照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程及線性范圍，見表1。

表1 酸棗5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和酸棗仁皂苷D的RSD分別為0.26%、0.17%、2.49%、2.78%、3.64%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下同一批酸棗仁供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)色譜峰面積計(jì)算各成分RSD，結(jié)果表明，斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和酸棗仁皂苷D的峰面積RSD 分別為4.52%、4.73%、0.99%、4.56%和4.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下同一批酸棗仁供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，根據(jù)各成分色譜峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果表明，斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 和酸棗仁皂苷D 的RSD 分別為3.61%、2.55%、3.87%、2.39%和2.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的酸棗仁樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別精密滴加對照品溶液1 mL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分回收率。結(jié)果斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B及酸棗仁皂苷D的平均回收率分別為99.04%、98.57%、98.13%、98.25%、97.41%，RSD分別為1.93%、1.49%、1.88%、2.52%、3.36%，表明加樣回收率良好。

2.4 樣品含量測定

取不同采收時間的酸棗葉、酸棗果肉及酸棗仁樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算5種成分的含量，結(jié)果見表2～表4。

表2 不同采收時間野生與野生撫育酸棗葉5種成分含量（%，n=3）

表3 不同采收時間野生與野生撫育酸棗果肉5種成分含量（%，n=3）

2.4.1 不同采收時間酸棗葉5種成分含量變化趨勢

對不同采收時間野生與野生撫育酸棗葉中斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B及酸棗仁皂苷D的含量進(jìn)行分析。5月份酸棗葉中皂苷類成分含量較低未檢測出，僅檢測到少量黃酮類成分，分析其原因可能是，仲山山區(qū)海拔較高，4月初至5月初氣溫較平原地區(qū)偏低，枝葉還并不茂盛，新陳代謝較慢，次生代謝產(chǎn)物合成累積量偏少。隨生長期延長，野生酸棗葉與野生撫育酸棗葉中斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素和酸棗仁皂苷D含量相近，變化趨勢基本一致。野生酸棗葉中酸棗仁皂苷A含量較高于野生撫育酸棗葉，兩者隨生長期的變化趨勢一致。野生酸棗葉與野生撫育酸棗葉中酸棗仁皂苷B含量相近，生長前期野生撫育酸棗葉中酸棗仁皂苷B含量高于野生酸棗葉。不同采收時間野生與野生撫育酸棗葉中5種成分含量變化趨勢見圖2。

圖2 不同采收時間野生與野生撫育酸棗葉5種成分含量變化趨勢

2.4.2 不同采收時間酸棗果肉5種成分含量變化趨勢

野生和野生撫育酸棗果肉中皂苷類成分均含量較低，3種酸棗仁皂苷均未達(dá)到檢測限，僅檢測到斯皮諾素和6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素。野生與野生撫育酸棗果肉中斯皮諾素含量呈先降低后上升趨勢，且野生撫育酸棗果肉中斯皮諾素含量較高。6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素含量整體呈降低趨勢，野生酸棗果肉的含量略高于野生撫育酸棗果肉。不同采收時間野生與野生撫育酸棗果肉中斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素含量變化趨勢見圖3。

圖3 不同采收時間野生與野生撫育酸棗果肉2種成分含量變化趨勢

2.4.3 不同采收時間酸棗仁5種成分含量變化趨勢

2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定酸棗仁皂苷A 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不少于0.030%，尚未規(guī)定酸棗仁皂苷B和酸棗仁皂苷D的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]。本研究中，野生和野生撫育酸棗仁中酸棗仁皂苷D含量較低，9月25日及之前采集的樣品均未檢測到，在10月份完全成熟期檢測到少量該成分，其余4種成分均可檢測到。隨著生長期延長，野生和野生撫育酸棗仁中斯皮諾素含量變化趨勢基本一致，在前期生長過程中，酸棗仁成分含量積累差異較大，后期逐漸趨于平穩(wěn)。野生和野生撫育酸棗仁中6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素含量逐漸上升，兩者變化趨勢相似。野生和野生撫育酸棗仁中酸棗仁皂苷A含量均呈現(xiàn)上升趨勢。野生撫育酸棗仁中酸棗仁皂苷B含量普遍高于野生酸棗仁。在9月9日之后采收的野生和野生撫育酸棗仁斯皮諾素和酸棗仁皂苷A含量均高于藥典規(guī)定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由此可知，以9月下旬至10月上旬采收酸棗仁為宜。不同采收時間野生與野生撫育酸棗仁中斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B含量變化趨勢見圖4。

圖4 不同采收時間野生與野生撫育酸棗仁4種成分含量變化趨勢

3 討論

2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，酸棗仁的指標(biāo)性成分為酸棗仁皂苷A和斯皮諾素，難以全面評價酸棗仁質(zhì)量。酸棗仁中發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神功效的主要是黃酮類和皂苷類成分[17-20]，本研究選擇黃酮類成分斯皮諾素和6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素，以及皂苷類成分酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B及酸棗仁皂苷D作為待測成分，為野生酸棗和野生撫育酸棗的品質(zhì)評價提供依據(jù)。

本研究比較不同采收時間野生與野生撫育酸棗葉、果肉及種仁斯皮諾素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B及酸棗仁皂苷D含量，結(jié)果表明，野生和野生撫育酸棗不同部位5種化學(xué)成分含量變化差異較小。酸棗葉目前主要作茶飲，具有安神功效。有文獻(xiàn)報(bào)道，酸棗葉作茶飲最佳采收時間為5-6月[21]。本研究中，5月份采收的酸棗葉中3種酸棗仁皂苷均未檢測到，可能由于地理環(huán)境、氣候條件等因素差異導(dǎo)致。6-7月份時各成分含量較其他采收期高，作茶飲可在此時期采摘。6月份后采收的酸棗葉中，5種成分均可檢測到，故酸棗葉可作為提取酸棗黃酮類成分和皂苷類成分的新藥用部位，以擴(kuò)大藥源，其藥效仍需進(jìn)一步研究。酸棗果肉僅檢測到少量黃酮類成分，未檢測到皂苷類成分，反映了我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論關(guān)于酸棗種仁入藥的合理性。本研究結(jié)果表明，9月下旬至10月上旬，酸棗仁完全成熟后其黃酮類和皂苷類成分含量相對最高，為保證酸棗仁質(zhì)量，可將該時段作為最佳采收期。酸棗活性成分的累積趨勢可能與不同發(fā)育階段及相應(yīng)的生理代謝活動等相關(guān)，此方面內(nèi)容有待進(jìn)一步研究。本研究根據(jù)酸棗在不同生長階段呈現(xiàn)不同的性狀特征，參考不同生長發(fā)育期成分累積特點(diǎn)劃分藥材的合理采收期。野生酸棗與野生撫育酸棗中各成分含量隨生長期的變化規(guī)律基本相似、含量相近，甚至野生撫育酸棗一些成分含量高于野生酸棗，因此酸棗野生撫育技術(shù)不僅可以提供豐產(chǎn)性，解決酸棗供需矛盾，而且酸棗仁品質(zhì)有保障，有利于促進(jìn)醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展。