渴腎方對糖尿病腎病大鼠腎小管間質(zhì)損傷的影響

馮曉軒，王琛

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖代謝異常引起的腎小球硬化癥，屬微血管病變，是終末期腎病的主要原因之一[1]。DN 全球發(fā)病率逐年升高，患病人數(shù)超過3.5億[2]，但目前發(fā)病機(jī)制仍不明確，且尚無有效治療手段。DN主要與腎血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、炎癥、缺氧和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）過度激活有關(guān)[3]。對于DN腎損傷的研究主要集中于腎小球，但近年研究表明，DN早期腎損傷與腎小管關(guān)系密切，不僅可反映DN炎癥和纖維化程度、氧化應(yīng)激和重吸收能力，還與腎功能水平下降及DN病程進(jìn)展密切相關(guān)[4]。DN腎小管結(jié)構(gòu)改變主要包括腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮、間質(zhì)性炎癥、間質(zhì)纖維化和血管異常[5]。有研究顯示，DN早期腎小球處于超濾狀態(tài)，因此限制近端小管的重吸收是改善腎小球高濾過、延緩DN 病情的方法之一[6]，對DN 早期治療及預(yù)后有重要意義。

中醫(yī)藥在緩解DN癥狀方面優(yōu)于部分常規(guī)療法，且不良反應(yīng)少[7]。根據(jù)中醫(yī)辨證，早期DN多屬氣陰兩虛兼絡(luò)脈瘀阻證?？誓I方為王琛教授根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合DN患者多見水瘀互結(jié)致水腫的臨床表現(xiàn)，在消白方[8]基礎(chǔ)上加減化裁，加入桂枝、茯苓健脾利水化濕，又以赤芍、水蛭及少量大黃活血化瘀，收效良好。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）制備DN 大鼠模型，觀察渴腎方對模型大鼠腎小管間質(zhì)損傷的影響，初步探討其作用機(jī)制，為該方臨床治療DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

6周齡SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量160～180 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，溫度（23±3）℃，濕度55%±15%，12 h晝夜循環(huán)照明，自由攝食飲水。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批（PZSHUTCM210806002）。

1.2 藥物及制備

渴腎方由黃芪30 g、桂枝9 g、薏苡根30 g、鬼箭羽30 g、澤蘭15 g、茯苓15 g、赤芍15 g、水蛭9 g、蠶繭殼9 g、制大黃6 g組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑科制成水煎液，每毫升水煎液含原藥材9 g。恩格列凈片，德國勃林格殷格翰有限公司，10 mg/片，批號E27235，用蒸餾水制成0.86 mg/mL混懸液。

1.3 主要儀器與試劑

Nikon80i熒光顯微鏡+數(shù)碼成像系統(tǒng)，日本Nikon公司；卓越金采血糖儀，瑞士Roche公司；Certrifuge離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳及轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng)，上海天能。STZ，德國Sigma，貨號s0130；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，武漢博士德，貨號BM0002；CD68抗體，美國Santa Cruz公司，貨號sc-70761；纖維連接蛋白（FN）抗體，英國Abcam公司，貨號ab45688；β-actin 抗體，美國Proteintech 公司，貨號66009-1-Ig；白細(xì)胞介素（IL）-6抗體，武漢愛博泰克公司，貨號A11115；Masson三色染色液，珠海貝索生物，貨號BA4079A；PAS染色液，珠海貝索生物，貨號BA4080A；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國Thermo Scientific公司，貨號34095。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組10只和造模組40只，造模組予高糖高脂飼料（豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%）喂養(yǎng)8周，正常組予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。8周后造模組禁食12 h，腹腔注射1%STZ 溶液30 mg/kg[9]（臨用前以0.1 mol/L、pH 4.4枸櫞酸緩沖液溶解），72 h后檢測大鼠隨機(jī)血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性并穩(wěn)定5 d，2周后檢測尿蛋白定性陽性，即為造模成功[10]。

2.2 分組及給藥

剔除死亡及未成模大鼠10只，將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、渴腎方組和恩格列凈組，每組10只。以成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（60 kg）的10倍計算大鼠每日給藥劑量，恩格列凈組為1.72 mg/只，渴腎方組為18 g/只，正常組和模型組予生理鹽水2 mL/只，連續(xù)8周。給藥期間除正常組外，其余組繼續(xù)予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

2.3 取材

給藥第8周末，代謝籠留取大鼠24 h尿液。大鼠禁食12 h，尾靜脈采血檢測空腹血糖，以2%戊巴比妥鈉腹腔注射（2 mL/kg）麻醉大鼠，腹主動脈取血，摘取左腎，一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)石蠟包埋后制成3 μm切片，用于腎組織病理觀察及免疫組化染色，另一部分置于-80 ℃液氮中保存，用于Western blot檢測。

2.4 大鼠血清及尿液生化指標(biāo)檢測

血液及尿液樣本離心后取上清液，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清膽固醇含量；采用免疫散射比濁法檢測尿白蛋白，GOD法檢測尿肌酐，計算尿白蛋白/肌酐比率（UACR）。以上檢測均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。

2.5 腎組織病理觀察

2.5.1 PAS染色

腎組織切片脫蠟至水，于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡20 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各10 min，梯度乙醇（95%、90%、80%、70%）各5 min，蒸餾水洗，PBS洗3次，每次3 min，置于過碘酸乙醇溶液染色10 min，流水洗后去離子水洗3次，Schiff溶液染色15 min，流水沖洗，蘇木素染核1 min，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，中性樹膠固定，顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)。

2.5.2 Masson染色

腎組織切片脫蠟至水，于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡20 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各10 min，梯度乙醇（95%、90%、80%、70%）各5 min，蒸餾水洗，蘇木素染核1 min，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，麗春紅溶液染色10 min，蒸餾水沖洗，1%磷鉬酸處理5 min，1%苯胺藍(lán)復(fù)染10 min，1%冰醋酸分化1 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察腎組織膠原纖維沉積情況。

2.6 免疫組化染色

腎組織石蠟切片脫蠟復(fù)水后，EDTA 抗原修復(fù)20 min，PBS沖洗后滴加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加α-SMA、CD68一抗（1∶500），37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗后加二抗，室溫孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，計算陽性表達(dá)的平均光密度（MOD）。

2.7 Western blot檢測

腎組織用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白樣品。蛋白上樣后120 V電泳60 min，濕轉(zhuǎn)法100 V轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加FN 一抗（1∶3 000）、IL-6 一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃搖床孵育過夜，滴加HRP標(biāo)記IgG（1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST洗3次，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件計算目的蛋白相對灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用-±s表示，多樣本均數(shù)比較，符合正態(tài)分布及方差齊性用方差分析，組間比較用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 渴腎方對模型大鼠空腹血糖、血清膽固醇、尿白蛋白/肌酐比率的影響

與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、血清膽固醇、UACR明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，渴腎方組和恩格列凈組大鼠空腹血糖、血清膽固醇及UACR明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 給藥8周末各組大鼠空腹血糖、血清膽固醇、UACR比較（-±s）

表1 給藥8周末各組大鼠空腹血糖、血清膽固醇、UACR比較（-±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

UACR/（mg/g）1.53±0.73 5.29±0.95**3.14±0.62#2.67±0.62#組別正常組模型組渴腎方組恩格列凈組只數(shù)5 5 5 5空腹血糖/（mmol/L）5.46±0.51 21.20±2.23**15.92±6.16#11.65±2.58#血清膽固醇/（μmol/L）1.43±0.15 2.98±1.46**1.63±0.22#1.90±0.38#

4.2 渴腎方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

PAS染色顯示，正常組大鼠腎小球形態(tài)正常，無基底膜增厚及系膜基質(zhì)增生，腎小管無水腫、空泡樣變，腎間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生；模型組大鼠可見系膜基質(zhì)增生、基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤；渴腎方組和恩格列凈組大鼠系膜基質(zhì)輕度增生，基底膜輕微增厚，腎小管輕度水腫，腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管及間質(zhì)損傷較模型組有一定程度減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（PAS染色， 標(biāo)尺=100 μm）

Masson染色顯示，正常組大鼠腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)無纖維化改變；模型組大鼠腎小管基底膜增厚，部分上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)大量膠原纖維沉積；與模型組比較，渴腎方組和恩格列凈組大鼠腎小管基底膜增厚改善，腎間質(zhì)膠原纖維沉積明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色， 標(biāo)尺=100 μm）

4.3 渴腎方對模型大鼠腎組織α-平滑肌肌動蛋白、CD68表達(dá)的影響

α-SMA陽性表達(dá)呈棕黃或褐色顆粒，CD68陽性表達(dá)呈藍(lán)紫色顆粒。正常組大鼠腎組織未見α-SMA和CD68陽性表達(dá)；與正常組比較，模型組大鼠腎組織α-SMA和CD68陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，渴腎方組和恩格列凈組大鼠腎組織α-SMA和CD68陽性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖3、圖4、表2。

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA陽性表達(dá)（免疫組化染色， 標(biāo)尺=100 μm）

圖4 各組大鼠腎組織CD68陽性表達(dá)（免疫組化染色， 標(biāo)尺=100 μm）

表2 各組大鼠腎組織α-SMA、CD68表達(dá)比較（-±s，MOD）

表2 各組大鼠腎組織α-SMA、CD68表達(dá)比較（-±s，MOD）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

CD68 0.033±0.001 0.242±0.004**0.078±0.008#0.143±0.002#組別正常組模型組渴腎方組恩格列凈組只數(shù)4 4 4 4 α-SMA 0.040±0.006 0.411±0.056**0.198±0.047#0.250±0.046#

4.4 渴腎方對模型大鼠腎組織纖維連接蛋白和白細(xì)胞介素-6蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織FN、IL-6蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，渴腎方組和恩格列凈組大鼠腎組織FN、IL-6表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見表3、圖5。

圖5 各組大鼠腎組織FN、IL-6蛋白免疫印跡

表3 各組大鼠腎組織FN、IL-6蛋白表達(dá)比較（-±s）

表3 各組大鼠腎組織FN、IL-6蛋白表達(dá)比較（-±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

IL-6 0.55±0.15 0.94±0.05**0.61±0.16#0.49±0.20#組別正常組模型組渴腎方組恩格列凈組只數(shù)4 4 4 4 FN 0.56±0.23 1.13±0.18**0.78±0.09#0.66±0.27#

5 討論

DN 進(jìn)展的最主要危險因素是高血糖、高血壓[11]，在高糖環(huán)境下，近端腎小管重吸收功能失衡可導(dǎo)致形態(tài)變化，致使炎癥、纖維化發(fā)生，加速DN 進(jìn)展[12]。DN患者高血壓與胰島素抵抗、胰島素分泌缺乏導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂及動脈粥樣硬化相關(guān)。高血壓可使管-球反饋機(jī)制出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能異常，出現(xiàn)蛋白尿。蛋白尿是DN進(jìn)展的重要指標(biāo)之一，因此，改善糖脂代謝水平對減少DN 患者尿蛋白排出，延緩DN進(jìn)程有一定作用。

胰島炎癥引起的胰島素抵抗是糖尿病發(fā)生的重要誘因[13]。CD68是一種高度糖基化的糖蛋白，在巨噬細(xì)胞和其他單核細(xì)胞中高度表達(dá)。研究表明，巨噬細(xì)胞極化是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵原因，參與胰島炎癥反應(yīng)，直接影響DN的發(fā)展[14]。慢性腎損傷的普遍特征是由免疫介導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化[15]，肌成纖維細(xì)胞分化被認(rèn)為是腎纖維化發(fā)展的重要表現(xiàn)之一[16]。α-SMA是活化的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白[17]，是腎組織纖維化標(biāo)志物之一[18]。Gerrits等[19]研究表明，DN腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞累積可加速腎間質(zhì)纖維化形成。在一定條件下，巨噬細(xì)胞甚至可以轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，直接介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化[20]。炎癥可加重腎臟疾病進(jìn)展[21]，炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化與多種炎癥因子分泌有關(guān)[22]。IL-6是DN炎癥反應(yīng)進(jìn)展的核心指標(biāo)之一[23]，在腎組織中廣泛表達(dá)。一項(xiàng)臨床觀察顯示，IL-6水平是DN進(jìn)展的獨(dú)立危險因素[24]。炎癥因子可通過激活多種信號通路導(dǎo)致腎纖維化，腎纖維化是多種慢性腎病的最終表現(xiàn)[25]。FN是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白，由成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞分泌合成的細(xì)胞纖連蛋白構(gòu)成，與纖維化進(jìn)程密切相關(guān)[26]。腎小管間質(zhì)纖維化是DN的關(guān)鍵病理特征[27]，因此，選取觀察炎癥及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)與病理相符，可更加客觀評價渴腎方的療效。本實(shí)驗(yàn)中，渴腎方組大鼠UACR較模型組明顯改善，故對DN大鼠腎組織進(jìn)行病理檢測，以證實(shí)其有效性。PAS染色顯示，與模型組相比，渴腎方組在改善腎間質(zhì)炎性浸潤等方面有明顯作用；Masson染色顯示，與模型組相比，渴腎方組在改善腎間質(zhì)纖維化方面有一定效果，也從一定程度上表明，渴腎方可能是通過減輕炎癥反應(yīng)延緩腎纖維化進(jìn)程。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一猜想，選取炎癥與纖維化相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。免疫組化染色結(jié)果表明，渴腎方組大鼠腎組織CD68、α-SMA陽性表達(dá)明顯低于模型組，Western blot結(jié)果表明，與模型組相比，渴腎方組大鼠腎組織IL-6、FN蛋白表達(dá)明顯降低。表明渴腎方可能通過減輕腎組織炎癥反應(yīng)，抑制纖維化發(fā)生，延緩DN進(jìn)展。

DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”之“下消”或“消腎”等范疇。《太平圣惠方》有“夫消腎，小便白濁如脂者。此由勞傷于腎，腎氣虛冷故也”，其癥狀與DN 臨床表現(xiàn)相符。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，早期DN病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以陰虛為本，燥熱為標(biāo)。渴腎方中以黃芪為君，取其益氣健脾、利水消腫之效，臣以桂枝溫通經(jīng)脈、助陽化氣，二藥相合，意在調(diào)和營衛(wèi)、益氣化濕，使中焦之氣得以運(yùn)化，下焦之寒得以溫煦；薏苡根清熱通淋、健脾利濕，澤蘭利水消腫、活血化瘀，茯苓利水滲濕、健脾寧心，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，鬼箭羽破血通經(jīng)、解毒消腫，水蛭逐瘀消癥，制大黃活血通經(jīng)、推陳致新，以上共為佐藥，以加強(qiáng)健脾利濕、益氣化瘀之功；蠶繭殼祛風(fēng)勝濕、調(diào)和諸藥為使。諸藥相合，奏健脾益氣、化濕通絡(luò)之功。

綜上所述，渴腎方能改善DN 大鼠腎小管間質(zhì)損傷，其作用機(jī)制可能是通過抑制CD68、IL-6表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，抑制α-SMA、FN表達(dá)，抑制腎間質(zhì)纖維化發(fā)展，從而延緩DN進(jìn)程。