基于GAS5/miR-21介導(dǎo)的細胞增殖探討心康沖劑抗心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用機制

劉蓉芳 ，郭冰 ，余意 ，李園 ，王敏

1.暨南大學(xué)附屬江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208

心肌纖維化是心肌結(jié)構(gòu)重塑的重要特征[1]，而心肌成纖維細胞（CFs）異常增殖是心肌纖維化開始和發(fā)展的關(guān)鍵步驟。miR-21被認為是許多心臟疾病如慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的預(yù)測和診斷指標[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過靶向抑制磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）增強PI3K/Akt通路活性，促進CFs增殖而導(dǎo)致心肌纖維化[3]。生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（GAS5）是一種控制細胞增殖和生長的長鏈非編碼RNA，可通過調(diào)控miR-21表達使PTEN表達增加[4]，通過抑制周期蛋白D1（CyclinD1）和周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）表達抑制細胞增殖[5]。而目前從調(diào)控GAS5/miR-21介導(dǎo)細胞增殖角度研究中醫(yī)藥抗心肌纖維化的報道較少。

心康沖劑是全國名老中醫(yī)毛以林教授治療CHF的經(jīng)驗方。前期研究發(fā)現(xiàn)，心康沖劑可抑制miR-21 表達，通過調(diào)控PTEN/Akt通路逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[6-7]，但其對GAS5表達及成纖維細胞增殖的調(diào)控作用尚不明確。本研究通過觀察心康沖劑對CHF 大鼠GAS5、miR21、PTEN基因表達及CFs增殖的影響，進一步探討其抗心肌纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

5 周齡SPF 級SD 大鼠46 只，雌雄各半，體質(zhì)量（170±10）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度50%±10%，每日光照12 h，自由攝食飲水，標準飼料喂養(yǎng)。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批（LLBH-202105180002）。

1.2 藥物及制備

心康沖劑（黃芪30 g，人參10 g，升麻5 g，柴胡5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，陳皮10 g，麩炒白術(shù)10 g，薏苡仁30 g，砂仁6 g，制附片10 g，桂枝10 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室制成干燥顆粒，10 g顆粒相當于原藥材3.38 g。纈沙坦膠囊，北京諾華制藥有限公司，批號X2925，80 mg/粒。注射用鹽酸阿霉素，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號2103E3，10 mg/瓶。

1.3 主要試劑及儀器

PTEN、Akt、CyclinD1、CDK4、GAPDH 抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG，美國Proteintech，貨號分別為22034-1-AP、10176-2-AP、26939-1-AP、11026-1-AP、10494-1-AP、SA00001-1、SA00001-2；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，美國Boster，貨號BM0000；Ⅰ型膠原（ColⅠ）ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司，貨號CSBE08084r；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）ELISA試劑盒，美國Proteintech，貨號KE20006；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀，貨號CW2569；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀，貨號CW2141。熒光定量PCR儀（美國Thermo，型號PIKOREAL96），-80 ℃冰箱（中國美菱，型號DW-HW438），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號H1650R），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號H1650R），小動物專用彩色多普勒超聲儀（飛依諾科技有限公司，型號6LAB），全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號PW-812），多功能酶標分析儀（深圳匯松科技發(fā)展有限公司，型號MB-530），顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（廈門Motic，型號BA410T）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機取6只作為正常組，余40只行阿霉素腹腔注射造模[8]。將10 mg阿霉素粉針劑溶于生理鹽水5 mL，配成濃度為2 mg/mL溶液，按1.5 mg/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)7周。正常組注射生理鹽水1 mL/kg。末次注射后正常飼養(yǎng)1周，行心臟超聲檢測，并隨機取4只造模大鼠左心室心肌和肺組織行HE、Masson染色。以大鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質(zhì)量增長緩慢、毛發(fā)枯黃、腹水等表現(xiàn)，超聲心動圖示左室短軸縮短率（LVFS）＜30%[9]，HE染色見心肌細胞溶解，Masson染色見大量藍色膠原纖維[10]，即為造模成功。造模中共8只大鼠死亡，剩余32只成模大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組12只、心康沖劑組和纈沙坦組各10只。

2.2 給藥

參考前期給藥劑量[11]，心康沖劑組予心康沖劑0.5 g/kg灌胃，纈沙坦組予纈沙坦30 mg/kg灌胃，正常組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，每日1 次，連續(xù)4周。

2.3 指標檢測

2.3.1 心臟超聲檢測

大鼠予2.5%異氟烷吸入麻醉，取胸前仰臥位固定，脫毛后涂耦合劑，用小動物專用彩色多普勒超聲儀，取大鼠左心室長軸切面行M型超聲檢測，連續(xù)記錄10 個心動周期，測量LVFS 和左室射血分數(shù)（LVEF）。

2.3.2 ELISA檢測

大鼠經(jīng)腹主動脈采血10 mL，3 500 r/min 離心10 min，取血清，按照試劑盒說明書操作，酶標儀測量各孔光密度（OD值），根據(jù)標準曲線計算血清ColⅠ和MMP9含量。

2.3.3 HE染色

剪取大鼠左心室心尖投入液氮凍存。余下左心室投入10%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片，脫水、蘇木精染液染色后自來水沖洗，再經(jīng)75%鹽酸酒精分化、氨水處理、酸化伊紅乙醇液染色，梯度脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.3.4 Masson染色

取左心室組織石蠟切片，脫水，先后用10%重鉻酸鉀-10%三氯乙酸（1∶1）混合液、0.5%天晴石蘭、蘇木素溶液染色，自來水沖洗，再以0.5%鹽酸酒精分化液分化，復(fù)紅、脫水、透明、封固，采集5個包含2 mm2心肌面積區(qū)域圖像，應(yīng)用IBASⅡ圖像分析系統(tǒng)計算膠原容積分數(shù)（CVF）。CVF（%）=心肌膠原面積÷所測視野總面積×100%。

2.3.5 免疫熒光染色

左心室組織石蠟切片脫蠟、水化后，浸入EDTA緩沖液（pH=9.0）連續(xù)煮24 min后冷卻，PBS洗滌，3 min×3次，經(jīng)漂洗、脫水、蘇丹黑染色后封閉1 h，加入α-SMA一抗（1∶100），4 ℃避光孵育過夜，再滴加熒光二抗，DAPI避光染色，甘油封片，避光保存，采用熒光顯微鏡觀察，Image J軟件進行定量分析。

2.3.6 qRT-PCR檢測

稱取500 mg左心室組織樣品，剪碎后加入Trizol裂解，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目的基因表達量，引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.7 Western blot檢測

采用RIPA 裂解液提取大鼠左心室組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。分別取30 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE將蛋白分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗：Akt（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、CyclinD1（1∶500）、PTEN（1∶2 000）、GAPDH（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加二抗（HRP標記山羊抗小鼠IgG 1∶5 000、HRP 標記山羊抗兔IgG 1∶6 000），孵育，顯色、曝光、掃描，以GADPH為內(nèi)參，分析蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性采用方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD檢驗，方差不齊用Games Howell檢驗；不滿足正態(tài)性采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

正常組大鼠毛色光澤，眼睛有神，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量明顯增加，飲食及二便正常，無腹水及死亡；模型組大鼠毛發(fā)無光澤并脫落，活動遲鈍，精神萎靡，喜蜷縮，形體瘦小但嚴重腹水，生長基本停滯，大便稀，共死亡6只；心康沖劑組和纈沙坦組大鼠毛發(fā)較有光澤，動作較靈敏，體質(zhì)量有一定增加，有輕度腹水，各死亡4只。

4.1 心康沖劑對模型大鼠心功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠LVFS、LVEF顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠LVFS、LVEF顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠LVFS、LVEF比較（±s，%）

表2 各組大鼠LVFS、LVEF比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

LVEF 97.91±1.53 59.29±4.50*74.35±2.19△74.29±1.97△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數(shù)6 6 6 6 LVFS 75.05±5.54 27.59±2.86*38.30±1.83△38.15±1.64△

4.2 心康沖劑對模型大鼠血清Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶9含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠血清ColⅠ和MMP9 含量顯著減少（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

MMP9 980.074± 160.395 11 568.363±1 227.633*2 739.909±1 219.731△2 680.185± 716.984△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數(shù)6 6 6 6 ColⅠ802.778± 51.697 6 482.041±325.942*1 020.056±124.152△1 108.723±183.993△

4.3 心康沖劑對模型大鼠左心室病理形態(tài)的影響

HE染色顯示，正常組大鼠心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍色，心肌細胞壁完整，細胞排列整齊；模型組大鼠心肌細胞腫脹變性、胞漿溶解，細胞壁模糊，細胞排列紊亂；心康沖劑組和纈沙坦組大鼠心肌細胞腫脹、胞漿溶解程度相對較輕，部分細胞壁較完整。見圖1。

圖1 各組大鼠左心室組織形態(tài)（HE染色，×400）

Masson染色顯示，正常組大鼠肌纖維呈紅色，有極少量藍色膠原纖維；與正常組比較，模型組大鼠可見大量藍色膠原纖維，夾有紅色肌纖維，CVF顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠藍色膠原纖維相對較少，CVF 顯著減少（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 各組大鼠左心室CVF比較（±s，%）

表4 各組大鼠左心室CVF比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

CVF 4.270±1.074 26.310±4.586*13.603±1.394△14.737±3.756△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數(shù)6 6 6 6

4.4 心康沖劑對模型大鼠左心室α-平滑肌肌動蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室α-SMA表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑和纈沙坦組大鼠左心室α-SMA 表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠左心室α-SMA陽性表達（免疫熒光染色，×400）

表5 各組大鼠左心室α-SMA表達比較（±s）

表5 各組大鼠左心室α-SMA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

α-SMA 3 2 123.000±441.290 3 5 746.000±563.067*3 2 712.667± 88.342△3 2 726.667± 72.459△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數(shù)

4.5 心康沖劑對模型大鼠左心室生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄本5、miR-21、磷酸酶及張力蛋白同源物基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室GAS5、PTEN基因表達顯著降低，miR-21表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠左心室GAS5、PTEN基因表達顯著升高，miR-21表達顯著降低（P＜0.05）；與纈沙坦組比較，心康沖劑組GAS5基因表達降低，miR-21表達升高（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表達比較（±s）

表6 各組大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與纈沙坦組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組心康沖3 3劑組3組3纈沙坦PTEN 1.034±0.102 0.125±0.031*0.382±0.142△0.541±0.091△只數(shù)GAS5 1.036±0.105 0.184±0.029*0.367±0.083△▲0.593±0.081△miR-21 1.037±0.117 8.747±1.377*4.606±0.990△▲2.991±0.634△

4.6 心康沖劑對模型大鼠左心室Akt、周期蛋白依賴性激酶4、磷酸酶及張力蛋白同源物、周期蛋白D1 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著升高，PTEN蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著降低，PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖4、表7。

圖4 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表達比較（±s）

表7 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別CyclinD1只數(shù)Akt CDK4 PTEN正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組0.355±0.046 0.715±0.033*0.538±0.045△0.487±0.043△3 3 3 3 0.100±.0790 0.667±0.103*0.453±0.082△0.312±0.044△0.100±0.039 0.551±0.053*0.396±0.090△0.286±0.051△0.553±0.082 0.186±0.055*0.362±0.028△0.400±0.150△

5 討論

心肌纖維化可導(dǎo)致心功能異常，抗心肌纖維化是治療CHF的一個方向[12]。CFs活化增殖是心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。CyclinD1通過激活G1期特有的CDK4蛋白推動細胞周期由G1期進入S期，促進細胞分裂、增殖。當CyclinD1、CDK4過表達后，可促進成纖維細胞增殖，從而促使心肌纖維化發(fā)生[13]。PTEN可抑制Akt激活后上調(diào)的ColⅠ、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA及MMP2合成，抑制CyclinD1和CDK4誘導(dǎo)的細胞增殖[13-14]，阻止細胞G1/S期轉(zhuǎn)化，抑制纖維化形成[15]。相反，如PTEN表達被抑制，則上調(diào)CyclinD1、CDK4表達，促進細胞G1/S期轉(zhuǎn)化，促使纖維化形成。長鏈非編碼RNA GAS5可以堿基互補配對為基礎(chǔ)共享結(jié)合miR-21 反應(yīng)元件，通過“海綿樣”吸附miR-21，使miR-21 功能降低或喪失，削弱miR-21 對PTEN 的抑制，使PTEN在轉(zhuǎn)錄水平表達升高[16]，從而抑制Akt活化后誘導(dǎo)的細胞增殖。

根據(jù)臨床癥狀，可將心肌纖維化歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“喘證”“水腫”等范疇。毛以林教授經(jīng)過長期臨床實踐認為，心力衰竭心肌纖維化的關(guān)鍵病機是宗氣下陷、脾腎陽虛、水濕內(nèi)停[17]。心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術(shù)散為基礎(chǔ)組成，能升補宗氣、溫陽利水，對CHF水濕浸漬患者能利尿消腫，提高心功能，改善預(yù)后。方中大劑黃芪、人參補心肺以升宗氣，共為君藥；茯苓、薏苡仁健脾利水，陳皮行氣利水，砂仁運脾化濕，共為臣藥；制附片溫腎陽，桂枝溫陽化氣，生姜皮、大腹皮專利肌膚之水，共為佐藥；柴胡、升麻提升清陽之氣，桔梗舟楫之藥，為使，諸藥和而為功。前期研究表明，心康沖劑可抑制miR-21、Akt表達，促進PTEN表達，逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[6-7，18]。本實驗顯示，模型組大鼠HE 染色可見心肌細胞溶解，LVFS、LVEF降低，說明其心功能下降。免疫熒光染色、Masson染色顯示模型組大鼠心肌纖維化明顯，且miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1、MMP9、ColⅠ表達升高，GAS5、PTEN 表達降低，提示模型組大鼠GAS5、PTEN表達受抑制，CFs增殖活躍。經(jīng)心康沖劑干預(yù)后，模型大鼠LVEF、LVFS升高，心肌細胞腫脹較輕，MMP9、ColⅠ含量降低，說明心康沖劑可提高大鼠心功能，減輕心肌纖維組織增生，可能通過上調(diào)GAS5、PTEN 表達，下調(diào)miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1表達阻滯CFs增殖。本研究探討了心康沖劑對GAS5/miR-21 介導(dǎo)的CHF 大鼠CFs 增殖的調(diào)控作用，為心康沖劑抗心肌纖維化提供更多依據(jù)。然而本結(jié)果并未完全說明心康沖劑可通過GAS5/miR-21靶向調(diào)控PTEN/Akt通路抑制CDK4、CyclinD1表達，從而實現(xiàn)細胞增殖阻滯。今后將分別對GAS5、miR-21進行靶向調(diào)控，再觀察心康沖劑對PTEN/Akt通路及CFs增殖的影響，以進一步明確其是否通過GAS5/miR-21靶向調(diào)控PTEN/Akt通路抑制細胞增殖。