基于Wnt/β-catenin信號通路的復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化的影響

喬明珠 ，呂浩 ，胡芷苜 ，梁龍 ，江渟

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230031； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少、骨組織微小結(jié)構(gòu)發(fā)生變化為主要特征的骨代謝疾病之一，容易引起骨脆性增加、骨折風(fēng)險升高[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是一類能在機體內(nèi)自行更新并分化為中胚層細胞、具有多向分化潛能的成體干細胞[2]。BMSCs的增殖能力減弱會引起成骨細胞活力下降和成骨分化能力受到抑制[3]。研究表明，骨-脂間平衡與BMSCs分化為成骨細胞或成脂細胞有重大聯(lián)系，OP是骨-脂間平衡被破壞導(dǎo)致的代謝性疾病，其特征為骨髓內(nèi)脂肪細胞過度積累而成骨細胞比例降低，骨量減少[4]。BMSCs促進骨修復(fù)主要是通過增強成骨分化，抑制成脂分化。因此，調(diào)控BMSCs分化對于代謝性骨病的治療至關(guān)重要。Wnt/β-catenin信號通路是BMSCs分化的經(jīng)典途徑[5]，主要由細胞外分泌蛋白Wnt家族細胞膜上的跨膜受體、胞質(zhì)內(nèi)的降解復(fù)合體和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等組成。成骨分化過程中的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和脂肪形成過程中的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ被認為是BMSCs分化的重要調(diào)節(jié)因子[6]，激活Wnt/β-catenin信號通路在促進BMSCs骨形成相關(guān)基因RUNX2和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix（Osx）表達的同時，可以抑制其分化為脂肪細胞，具有促成骨和抗成脂活性[7-8]，對維持骨量、促進成骨分化和骨代謝至關(guān)重要[9]。復(fù)方補腎活血顆粒是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，前期研究表明，該方能明顯改善OP患者中醫(yī)臨床癥狀、視覺模擬評分和骨密度[10]；體外實驗發(fā)現(xiàn)，其含藥血清具有促進BMSCs 增殖作用[11]。本研究基于Wnt/β-catenin信號通路觀察復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清對BMSCs成骨、成脂分化的影響，探討其發(fā)揮作用的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

SPF 級8 周齡SD 大鼠30 只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗中心，動物許可證號SCXK（皖）2017-001。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心標(biāo)準動物房，動物實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批。骨髓液取自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科手術(shù)患者（排除近5年內(nèi)患有糖尿病、嚴重腎功能不全、甲亢、甲減、血液疾病、惡性腫瘤等進而影響骨代謝者），用于分離培養(yǎng)BMSCs。臨床試驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 藥物及制備

復(fù)方補腎活血顆粒（首烏藤25 g，白芍20 g，淫羊藿20 g，黃芪18 g，川牛膝15 g，牡蠣10 g），飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。飲片加8倍量水浸泡1 h，煮沸30 min，過濾，再加6倍量水煎煮30 min，合并煎液，過濾，濃縮至1 mL藥液含原藥材2.9 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液、茜素紅染色液（上海碧云天生物，貨號分別為C3206、C0222、C0140），DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液（美國Hyclone 公司，貨號分別為SH30243.01、AC10217621），RUNX2 抗體、Osx 抗體、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）抗體、PPARγ抗體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）5抗體、β-catenin抗體（英國Abcam公司，貨號分別為ab76956、ab209484、ab40764、ab178860、ab223203、ab32572），0.25%胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（美國Invitrogen公司，貨號25200056、16000-044），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海新貝生物，貨號R202-02），BMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（南京建成生物，貨號分別為HUXMX-90021、HUXMX-90031），CCK-8試劑、RNA提取試劑盒（上海奕杉生物，貨號分別為100-106、RN001），油紅O染色液（北京索萊寶，貨號G1262）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國Eppendorf 公司，型號C170i），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號CX53），全波段酶標(biāo)儀（上海賽默飛公司，型號SkyHigh），梯度PCR 儀（美國ABI 公司，型號ABI VERITI），熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司，型號LightCycler 480Ⅱ），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5430R），Countstar細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物，型號IC1000），免疫印跡系統(tǒng)（上海天能公司，型號VE-180）。

2 實驗方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及分組

用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基）稀釋骨髓液后鋪于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 d，將細胞進行消化傳代，作為第1代BMSCs。取第3代BMSCs，以5×104個/mL接種至6孔板中，待細胞完全貼壁后，將細胞分為空白組（完全培養(yǎng)基）和含藥血清低、中、高劑量組（低、中、高劑量組，分別為2%、5%、8%含藥血清）。

2.2 含藥血清制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為含藥血清組和空白血清組（各15只）。按人與動物體質(zhì)量折算等效劑量，含藥血清組以6倍等效劑量（29 g/kg）灌胃[12]，灌胃體積10 mL/kg，空白血清組以等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥前12 h大鼠禁食不禁水，稱重后按60 mg/kg用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置1 h，3 500 r/min 離心20 min，取血清，56 ℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，15 mL離心管分裝，于-20 ℃冰箱保存。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力

收集狀態(tài)良好的第3～5代BMSCs，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔板，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復(fù)孔，24 h后分別更換為不同濃度含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)12、24、36、48 h后每孔加CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀波長450 nm處測定各孔細胞活力（OD值）。

2.4 堿性磷酸酶染色、茜素紅染色

BMSCs以5×104/mL密度接種于6孔板，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復(fù)孔，待細胞貼壁后，更換為含相應(yīng)血清的BMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)7 d后，PBS洗滌，加入40 g/L多聚甲醛溶液2 mL固定30 min，PBS洗滌，每孔加入ALP溶液1 mL充分反應(yīng)，顯微鏡下觀察。成骨誘導(dǎo)14 d后，按照上述方法固定和清洗BMSCs，加入1 mL茜素紅染色液反應(yīng)15 min，PBS沖洗，觀察鈣鹽沉積。

2.5 油紅O染色

BMSCs以5×104個/mL接種至6孔板中，將細胞按“2.1”項下分組，每組3個復(fù)孔，待細胞融合達到80%時，更換為含相應(yīng)血清的BMSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，換為含相應(yīng)血清的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液培養(yǎng)1 d，再次更換為培養(yǎng)基A液誘導(dǎo)，如此循環(huán)誘導(dǎo)14 d，PBS 輕柔洗滌，加入多聚甲醛溶液固定30 min，PBS沖洗2遍，每孔加入油紅O溶液2 mL，室溫染色30 min，顯微鏡下觀察染色效果。

2.6 RT-PCR檢測

將BMSCs 以5×104個/mL 接種于6 孔板中，按“2.1”項下分組，每組3個復(fù)孔，待細胞貼壁后，分別加入相應(yīng)含藥血清培養(yǎng)基2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3、5、7 d。按照試劑盒說明書抽提細胞中的RNA，紫外分光光度計測定濃度，根據(jù)PCR擴增體系和反應(yīng)條件進行擴增，利用RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ引物進行PCR，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。引物由上海新貝生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.7 Western blot檢測

將BMSCs按“2.6”項下方法處理后，PBS清洗3次，加入RIPA和PMSF混合液200 μL，裂解10 min提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，12%凝膠電泳分離等量蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加GAPDH一抗（1∶2 000）、RUNX2一抗（1∶300）、Osx一抗（1∶1 000）、C/EBPα一抗（1∶1 000）、PPARγ一抗（1∶1 000）、LRP5一抗（1∶1 000）、β-catenin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，孵育相應(yīng)二抗，利用Image J軟件對條帶進行分析，并計算目的蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；不滿足正態(tài)分布使用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)學(xué)特征

BMSCs首次換液后呈梭形或多角形分布，7 d左右可長滿培養(yǎng)瓶。傳至第3代，細胞生長速度加快，為較均一的長梭形，聚集生長，呈有方向性的魚群狀，細胞形態(tài)均勻。見圖1。

圖1 BMSCs形態(tài)學(xué)特征（×40）

4.2 復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞活力的影響

在一定濃度范圍內(nèi)，復(fù)方補腎活血顆粒可提高BMSCs細胞活力，其中以中劑量組作用最明顯，36 h達到高峰，說明復(fù)方補腎活血顆粒提高細胞活力不僅與劑量有關(guān)，也與作用時間有關(guān)。見圖2。

圖2 各組BMSCs細胞活力比較（±s，n=3）

4.3 復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化潛能的影響

成骨誘導(dǎo)分化7 d后，與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs ALP染色加深，其中以高劑量組顏色最深，陽性染色面積最大，顯微鏡下可見無規(guī)則的形態(tài)變化，局部有一定的細胞聚集，并有大量鈣化結(jié)節(jié)。見圖3。成骨誘導(dǎo)分化14 d 后，與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs染色加深，橘紅色沉淀增多，說明礦化結(jié)節(jié)增加。見圖4。

圖3 各組BMSCs形態(tài)（ALP染色，×40）

圖4 各組BMSCs形態(tài)（茜素紅染色，×40）

4.4 復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化潛能的影響

成脂誘導(dǎo)分化14 d后，BMSCs形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形，其油脂可被油紅O染為紅色。與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs顏色逐漸變淺，表明脂滴數(shù)量逐漸減少，其中以高劑量組脂滴減少最為明顯。見圖5。

圖5 各組BMSCs形態(tài)（油紅O染色，×40）

4.5 復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化相關(guān)基因表達的影響

與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs培養(yǎng)3、5、7 d后，成骨相關(guān)因子RUNX2和Osx mRNA表達升高，成脂相關(guān)因子C/EBPα和PPARγ mRNA表達降低，除3 d低劑量組Osx、RUNX2、PPARγ，3 d中劑量組Osx、RUNX2和5 d低、中劑量組RUNX2外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見圖6。

圖6 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ mRNA表達比較（±s）

4.6 復(fù)方補腎活血顆粒對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨、成脂分化相關(guān)蛋白表達的影響

與空白組比較，低、中、高劑量組BMSCs培養(yǎng)3、5、7 d 后RUNX2 和Osx 蛋白表達升高，C/EBPα 和PPARγ蛋白表達降低，其中高劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見表2、表3、圖7。

圖7 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx、C/EBPα、PPARγ蛋白免疫印跡

表2 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx蛋白表達比較（±s）

表2 各組BMSCs不同時點RUNX2、Osx蛋白表達比較（±s）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 d 5 d 7 d Osx 0.84±0.01 0.91±0.01 0.94±0.02 1.30±0.09**RUNX2 0.76±0.02 0.91±0.02 1.28±0.53 1.27±0.05 Osx 0.73±0.03 0.83±0.03**0.84±0.01**1.28±0.05***RUNX2 0.82±0.03 0.90±0.02*0.96±0.02 1.15±0.05**Osx 0.73±0.01 0.84±0.03*1.10±0.05**1.20±0.03**RUNX2 0.68±0.01 0.79±0.05*0.87±0.02*1.21±0.01**

表3 各組BMSCs不同時點C/EBPα、PPARγ蛋白表達比較（±s）

表3 各組BMSCs不同時點C/EBPα、PPARγ蛋白表達比較（±s）

注：與空白組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組n 3 3 3 3 3 d 5 d 7 d PPARγC/EBPαPPARγC/EBPαPPARγ 1.09±0.10 0.91±0.03*0.73±0.04***0.50±0.26***C/EBPα 1.20±0.01 0.98±0.02***0.52±0.03***0.49±0.04***0.80±0.60 0.96±0.02 0.74±0.07 0.60±0.05 0.94±0.07 0.68±0.12**0.70±0.01*0.57±0.02***1.08±0.10 0.82±0.10**0.57±0.03**0.48±0.01***1.21±0.10 0.81±0.02***0.60±0.01***0.56±0.02***

Western blot 檢測培養(yǎng)3、7 d 后LRP5、β-catenin蛋白表達。結(jié)果顯示，與空白組比較，中、高劑量組LRP5蛋白表達顯著升高，各組β-catenin蛋白表達均顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），見圖8、圖9。

圖9 各組BMSCs不同時點LRP5、β-catenin蛋白表達比較（±s）

5 討論

OP導(dǎo)致的脆性骨折帶來的嚴重并發(fā)癥具有較高的致殘率和病死率，在很大程度上威脅患者的生活質(zhì)量和身心健康[13]。OP屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”范疇，腎主骨、生髓，骨之強健，非骨髓之滋養(yǎng)不可，即“腎充則髓實”。腎的精氣盛衰對骨代謝的影響極為重要，腎虛精虧為OP核心病機[14]。多項臨床及實驗研究顯示，中藥復(fù)方在治療OP方面具有顯著優(yōu)勢[15-16]。復(fù)方補腎活血顆粒中淫羊藿、川牛膝入腎經(jīng)，具有補腎精、固筋骨作用；黃芪、牡蠣、首烏藤歸肝、腎經(jīng)，可補諸虛不足，具有補虛、益氣、通脈功效；白芍緩急止痛。BMSCs在OP發(fā)展過程中扮演重要角色，正常狀態(tài)下，成骨-成脂分化處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)代謝平衡被打破后，會造成骨代謝紊亂，進而引發(fā)OP等骨代謝疾病[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分OP 患者表現(xiàn)為BMSCs成骨分化能力減弱、成脂分化能力增強[19-20]。促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化，降低成脂細胞比例，對于改善骨-脂代謝，延緩OP進程具有重大意義。本研究以復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的BMSCs，觀察其對BMSCs增殖及成骨、成脂分化的影響，明確復(fù)方補腎活血顆粒發(fā)揮作用的機制。

ALP作為早期成骨標(biāo)志物，通過水解各種類型的磷酸鹽促進細胞成熟，在成骨分化過程中能夠促進細胞鈣化；茜素紅染色對成骨分化晚期鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量具有指示作用。二者均能直接反映成骨分化程度[21]。本實驗結(jié)果顯示，復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清能明顯促進BMSCs鈣化，形成鈣結(jié)節(jié)。油紅O染色結(jié)果表明，復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清能顯著降低BMSCs脂質(zhì)沉積，抑制BMSCs成脂分化能力。促進BMSCs向成骨細胞或成脂細胞分化的關(guān)鍵因素是提高與特異性細胞類型有關(guān)的基因表達，啟動和促進特異性細胞類型的分化[22]。RUNX2在BMSCs轉(zhuǎn)化為成骨細胞的過程中起關(guān)鍵作用，可促進BMSCs成骨分化，抑制BMSCs成脂分化，RUNX2缺失導(dǎo)致BMSCs無法分化為成骨細胞[23]。Osx 是BMSCs 成骨分化的另一重要轉(zhuǎn)錄因子，在RUNX2下游起作用，且可被RUNX2激活[24]。PPARγ不僅在脂肪細胞分化中起重要作用，而且對成骨相關(guān)因子RUNX2有負向調(diào)節(jié)作用，對骨形成有一定抑制作用[25]。C/EBPα作為PPARγ下游，其激活后能協(xié)同PPARγ發(fā)揮作用，調(diào)控多種成脂蛋白[26]。在成脂過程中，PPARγ和C/EBPα表達升高。通過在BMSCs分化的不同時點驗證復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清的作用，發(fā)現(xiàn)復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清能促進BMSCs分化不同階段的RUNX2和Osx表達。此外，干預(yù)后成脂分化關(guān)鍵因子PPARγ和C/EBPα表達降低，進一步表明復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清促進成骨分化、抑制成脂分化的藥效作用。

Wnt通路激活后，Wnt配體與LRP5/6受體結(jié)合，導(dǎo)致GSK-3β活性被抑制，進一步激活β-catenin，活化的β-catenin進入細胞核與核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成復(fù)合體，刺激下游相關(guān)基因表達。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活后促進BMSCs成骨分化，抑制成脂分化[27]，其關(guān)鍵分子β-catenin缺失會導(dǎo)致BMSCs成骨分化能力減弱，從而導(dǎo)致OP發(fā)生[28-29]。因此，通過檢測Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵蛋白LRP5和β-catenin表達，發(fā)現(xiàn)復(fù)方補腎活血顆粒含藥血清可顯著上調(diào)LRP5和β-catenin蛋白表達，提示復(fù)方補腎活血顆?？赡芡ㄟ^激活Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化。但考慮到中藥復(fù)方藥材的多樣性及化學(xué)成分的復(fù)雜性，其干預(yù)疾病的途徑及靶點并非單一，因此本研究結(jié)果仍需進一步探討。