土壤水分脅迫對(duì)不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶含量的影響

劉軍民，潘倍莎

1.中共舟曲縣委組織部，甘肅 甘南 746300；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070

在我國(guó)干旱、半干旱的黃土丘陵區(qū)，土壤水分影響著植物生理生態(tài)特性和生理生化特性[1]。在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不同的水分脅迫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)和生存帶來(lái)不同的影響[2]，所以對(duì)植物的抗旱性進(jìn)行研究具有必要性。

紫花苜蓿（Medicago sativa L）是干旱、半干旱地區(qū)普遍種植且產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景良好的優(yōu)良牧草品種，雖其耐旱性強(qiáng)，但需水量也高，故缺水是限制其生長(zhǎng)及牧草產(chǎn)量的主要因素[3]。新疆大葉苜蓿（Medicago sativa L .cv .Xingjiang Daye）是西北地區(qū)大面積種植的紫花苜蓿品種，土壤水分對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及生理生化特性有著十分重要的影響，進(jìn)而可能會(huì)影響到其產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究新疆大葉苜蓿在不同水分條件下的生理生化特性至關(guān)重要。

在植物抗旱生理研究中，MDA 含量是一個(gè)常用指標(biāo)。植物器官在逆境下遭受傷害，往往會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA 從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生反應(yīng)，使之喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質(zhì)的合成，因此，MDA 的積累會(huì)對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害，反過(guò)來(lái)說(shuō)，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。植物在干旱條件下會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，如超氧化陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等[4]。活性氧具有很強(qiáng)的化學(xué)活性[5]，能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使核酸斷裂突變，損壞細(xì)胞膜，而抗氧化酶可以減少這種傷害[6]。在植物體抗氧化過(guò)程中，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等各自分工，能夠清除部分活性氧自由基，減少活性氧對(duì)植物體的傷害[7]。在已有的研究中，月季在生育過(guò)程中MDA 含量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)[8]，唐苜蒲衰老過(guò)程中，MDA 含量一直在增長(zhǎng)[9]，含醉花在發(fā)育過(guò)程中MDA 含量逐漸增高[10]。

因此，研究土壤水分脅迫對(duì)不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶活性的影響，被認(rèn)為是培育耐旱基因植株富有前途的課題。

本研究通過(guò)在不同土壤水分脅迫下，研究不同茬次新疆大葉苜蓿葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT酶活性和MDA 的酶含量，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，為干旱、半干旱地區(qū)植物的抗旱性研究提供科學(xué)依據(jù)，以期提高其產(chǎn)量，發(fā)揮其優(yōu)良生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

盆栽試驗(yàn)于2020 年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)樓下模擬徑流場(chǎng)內(nèi)（103.69°E，36.09°N；海拔1 534.2 m）進(jìn)行，屬于溫帶大陸性氣候。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 試驗(yàn)內(nèi)容

通過(guò)測(cè)定不同水分條件下不同茬次的新疆大葉苜蓿丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性，分析土壤水分脅迫對(duì)不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響，為紫花苜蓿在干旱、半干旱地區(qū)的種植提供參考依據(jù)。

1.2.2 試驗(yàn)方法

采用盆栽觀測(cè)的方法：盆栽實(shí)驗(yàn)選用圓柱形聚乙烯桶，桶內(nèi)裝上過(guò)篩壤土，栽植新疆大葉苜蓿。

返青后用稱重法控制土壤水分，試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理，即土壤水分含量保持田間持水量的85 %，土壤水分含量保持田間持水量的65%，土壤水分含量保持田間持水量的45%。每個(gè)處理12 桶，共36 桶新疆大葉苜蓿。

生育期內(nèi)的全部降水用防雨棚遮去，每晚用稱重法均勻澆水，平衡桶重，并記錄每天的耗水量。

1.2.3 試驗(yàn)材料

兩年生的新疆大葉苜蓿。

1.2.4 測(cè)定方法

（1）過(guò)氧化物酶（POD）活性：愈創(chuàng)木酚比色法

在比色杯中依次加入0.05 mL 的上清液、2.65 mL 的0.3%愈創(chuàng)木酚，將比色杯放入分光光度計(jì)的比色槽中，加入0.3 mL 的0.6% H2O2（比色杯中液體總體積為3 mL），立即按開(kāi)始鍵，自動(dòng)計(jì)時(shí)2 min，記錄470 nm 處OD 值，按式（1）計(jì)算POD 活性。

（2）超氧物歧化酶（SOD）活性：氮藍(lán)四唑法

取5 mL 透明度好的指形管，依次加入1.5 mL的0.05 mol/L 磷酸緩沖液、0.3 mL 的130 mol/L Met、0.3 mL 的750 umol/L NBT 溶液、0.3 mL 的100 umol/L EDTA-Na2 溶液、0.25 mL 的蒸餾水，0.3 mL的20 umol/L 核黃素溶液和0.05 mL 的上清液（對(duì)照管中以緩沖液代替上清液），搖勻，將對(duì)照管置于暗處，測(cè)定管置于4 000 x 日光燈下顯色20 min 后，立即用黑色塑料袋進(jìn)行遮光處理，終止反應(yīng)。以對(duì)照管作空白調(diào)零，分別測(cè)出各測(cè)定管在560 nm 處的吸光度，按下式計(jì)算SOD 活性：

式中：Ao對(duì)照管吸光度；As樣品測(cè)定管吸光度；VT樣品提取液的總體積（mL）；Vs測(cè)定時(shí)取酶液量（mL）；FW 樣品鮮重（g）。

（3）過(guò)氧化氫酶（CAT）活性：紫外線吸收法

在比色杯中加入0.2 mL 上清液，將比色杯放入分光光度計(jì)的比色槽中，加入2.8 mL 的0.067 mo/L H2O2（比色杯中液體總體積為3 mL），立即按開(kāi)始鍵，自動(dòng)計(jì)時(shí)2 min，記錄240 nm 處的OD 值，按下式計(jì)算CAT 活性：

（4）丙二醛（MDA）測(cè)定：硫代巴比妥酸法

取0.3 g 植物樣片，放入冰浴的研缽中，加入少許石英砂和2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液，研磨成勻漿；將勻漿轉(zhuǎn)移到試管中，在用3 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液，分2 次（每次1.5 mL）沖洗研缽，合并濾液；在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液；將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內(nèi)溶液出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí)）；到時(shí)間后，立即將試管取出放入冷水浴中；試管溶液冷卻后，3 000 r/min 離心15 min 取上清液并量體積，以0.5%硫代巴比妥酸溶液為空白測(cè)532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光度，計(jì)算MDA 含量。

1.2.5 技術(shù)路線圖

下圖1 為研究土壤水分脅迫對(duì)不同茬次紫花苜蓿丙二醛及抗氧化酶含量影響的技術(shù)線路圖：

圖1 技術(shù)線路圖

2 實(shí)驗(yàn)處理與分析

研究抗氧化酶活性，采用盆栽觀測(cè)法，選擇圓形塑料桶，處理兩年生的新疆大葉苜蓿。采用稱重法控制土壤水分，設(shè)置3 個(gè)水分梯度（如下表1）。

表1 水分梯度

土壤水分處理標(biāo)記為T(mén)A、TB、TC；土壤含水量占田間持水量的百分比分別為85%、65%、45%；每個(gè)梯度選擇4 個(gè)桶進(jìn)行試驗(yàn)，每桶各取3 個(gè)植株，測(cè)定其葉片中各個(gè)抗氧化酶的活性和丙二醛含量。

2.1 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與繪圖；使用SPSS 進(jìn)行顯著性分析。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿丙二醛含量的影響

從總趨勢(shì)來(lái)看，兩茬MDA 含量均隨著生育期逐漸增長(zhǎng)。就TB 而言，第一茬從0.03 增加到0.07，第二茬從0.016 增加到0.072，且各個(gè)生育期內(nèi)的MDA 含量均是TC>TB>TC。第一茬中分枝期內(nèi)TA與TC 差異顯著，TB 與TC 同樣差異顯著（P<0.05）；在現(xiàn)蕾期內(nèi)TA 與TC 差異顯著，TB 與TC 差異顯著；其他生育期內(nèi)無(wú)顯著性差異。第二茬中只有現(xiàn)蕾期內(nèi)TA 與TC 差異顯著，TA 與TB 差異顯著，其余各個(gè)生育期內(nèi)均無(wú)顯著性差異。如圖2 所示。

圖2 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿丙二醛含量的影響

2.2.2 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿POD 活性的影響

圖3 顯示，兩茬中POD 活性均在分枝期達(dá)到最大值，且各時(shí)期POD 活性均在TB 下達(dá)最大值，說(shuō)明輕度水分脅迫有利于POD 酶活性的增強(qiáng)。在第一茬分枝期中，TA 與TB 差異性顯著，TB 與TC 差異性顯著（P<0.05）；開(kāi)花期中TA 與TC 差異性顯著，TA 與TB 差異性顯著，TB 與TC 同樣差異性顯著，且隨著生育期的發(fā)展呈先增高后降低的趨勢(shì)。POD活性在分枝期3 種水分脅迫下均達(dá)到最大值，同時(shí)在各個(gè)時(shí)期，POD 酶活性均在TB 下達(dá)最高值。在第二茬分枝期中TA 與TC 均與TB 差異性顯著，POD活性在現(xiàn)蕾期中3 種水分脅迫下兩兩差異性顯著，開(kāi)花期中TA 與TC 均與TB 差異性顯著。同樣，隨著生育期發(fā)展呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。就TB 而言，第一茬POD 活性從返青期的3.157 8 增長(zhǎng)到分枝期的6.543 6，再降低到開(kāi)花期的3.111 7，且在各個(gè)時(shí)期中POD 酶活性均在TB 下達(dá)到最大值。

圖3 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿POD 活性的影響

2.2.3 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿SOD 活性的影響

圖4 表明，從總體上看，兩茬中SOD 活性在分枝期達(dá)到最大值，且各時(shí)期SOD 酶活性均在TB 下達(dá)最大值，說(shuō)明相比之下輕度水分脅迫有利于SOD酶活性的增強(qiáng)。在第一茬中，除了現(xiàn)蕾期內(nèi)TA 與TC 沒(méi)有顯著性差異外（P<0.05），其余的各個(gè)時(shí)期均是兩兩有顯著性差異。且隨著生育期的發(fā)展呈先增高后降低的趨勢(shì)，在分枝期3 種水分脅迫下均達(dá)到最大值，同時(shí)在各個(gè)時(shí)期，SOD 酶活性均在TB 下達(dá)最高值。在第二茬中返青期與分枝期內(nèi)，均是兩兩有顯著性差異?，F(xiàn)蕾期內(nèi)TA 與TB 和TC 都有顯著性差異，開(kāi)花期內(nèi)TA 與TB 和TC 有顯著性差異，同樣隨著生育期發(fā)展呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，在第一茬TB 中從返青期的161.598 5 增長(zhǎng)到分枝期的266.383 1，再降低到開(kāi)花期的136.787 8，且在各個(gè)時(shí)期中SOD 酶活性均在TB 下達(dá)到最大值。

圖4 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿SOD 活性的影響

2.4 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿CAT活性的影響

圖5 表明，隨著生育期的發(fā)展，CAT 活性呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。圖中第二茬TB 下從返青期的16.868 4 增長(zhǎng)到分枝期的23.917 3，再降低到開(kāi)花期的18.295 0。在各個(gè)時(shí)期內(nèi)，CAT 酶活性均在TB下達(dá)到最大值。從兩茬的總體情況來(lái)看，在輕度水分脅迫（TB）下有利于CAT 酶活性的增強(qiáng)。在第一茬返青期和分枝期內(nèi)，TB 與TA 和TC 均有顯著性差異，在現(xiàn)蕾期和開(kāi)花期內(nèi)TC 與TA 和TB 均有顯著性差異（P<0.05），同時(shí)隨著生育期的發(fā)展，CAT 呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，且從整體上看，在各個(gè)時(shí)期內(nèi)，CAT 活性都在TB 下達(dá)到最大值；在第二茬返青期和分枝期內(nèi)，TB 與TA 和TB 均有顯著性差異，在現(xiàn)蕾期內(nèi)，TC 與TA 和TB 均有顯著性差異。

圖5 土壤水分脅迫對(duì)不同茬次新疆大葉苜蓿CAT 活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

在本次研究中，隨著土壤水分脅迫的加劇，MDA 酶含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（TC>TB>TA），而且隨著新疆大葉苜蓿生育期的發(fā)展而發(fā)展，即隨著植物器官衰老，MDA 酶含量逐漸增長(zhǎng)。這表明越是在逆境條件下，或者在植物器官衰老時(shí)，膜脂過(guò)氧化作用就越強(qiáng)烈，相應(yīng)地，其反應(yīng)的產(chǎn)物丙二醛（MDA）就越多。此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合MDA 在逆境或衰老時(shí)含量越高的規(guī)律。MDA 是對(duì)膜系統(tǒng)有毒害作用的物質(zhì)，其含量的多少能夠反應(yīng)出膜脂過(guò)氧化的程度，同時(shí)也能夠反應(yīng)出質(zhì)膜被破壞的程度。MDA 與膜結(jié)構(gòu)上的蛋白和酶結(jié)合，使蛋白結(jié)構(gòu)和酶失去活性，從而對(duì)膜結(jié)構(gòu)造成破壞，膜結(jié)構(gòu)被破壞后，自然其水勢(shì)會(huì)發(fā)生變化，所以植物進(jìn)入了衰老過(guò)程，隨著MDA 的積累，植物衰老的就越快。上述實(shí)驗(yàn)正好證明了這一點(diǎn)。而且CAT、SOD、POD 等保護(hù)性酶活性隨著紫花苜蓿的衰老，其活性降低，也是因?yàn)殡S著器官衰老MDA 逐漸積累而造成的。

此外，隨著水分脅迫的加劇，MDA 含量也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。這表明，隨著水分脅迫的加劇，植物器官能吸收的水分就相應(yīng)減少，滲透壓進(jìn)一步失調(diào)，加速了植物的衰老，因此MDA 的含量也就呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。這與張建文等對(duì)萱草MDA 含量的研究結(jié)果相似。張建文等研究表明月季切花在衰老過(guò)程中MDA 是緩慢增多的，郁金香在整個(gè)衰老過(guò)程中MDA 也是逐漸增多的[11-15]。本實(shí)驗(yàn)也同樣證明隨著紫花苜蓿的衰老，其MDA 含量是逐漸增多的。

過(guò)氧化物酶（POD）是最重要的抗氧化酶之一，POD 催化過(guò)氧化氫氧化氨類(lèi)和酚類(lèi)脫氫，脫下來(lái)的氫把H2O2還原成水，從而保護(hù)了膜系統(tǒng)[16]。本實(shí)驗(yàn)表明，在兩茬紫花苜蓿中POD 酶活性均是隨著生育期的發(fā)展，呈先增長(zhǎng)后緩慢降低的趨勢(shì)，在分枝期達(dá)到最大值。且在各個(gè)生育期內(nèi)，POD 酶活性均是在TB 下達(dá)到最大值。這說(shuō)明，在紫花苜蓿前期，MDA含量較少，因而保護(hù)酶活性較高，而隨著生育后期MDA 含量積累逐漸增多，對(duì)膜的危害越嚴(yán)重，加劇了植物器官的衰老，因此保護(hù)酶活性也相應(yīng)的降低。POD 酶在TB 水分脅迫下達(dá)到最大值，表明在TB 水分脅迫下POD 酶能起到最佳的抗旱和抗氧化的作用。

超氧化歧化酶（SOD）在植物體內(nèi)的含量很多，能夠清除氧自由基，使其生成氧分子和水，起到相應(yīng)的保護(hù)作用[17-18]，提高了植物的抗旱性。本次實(shí)驗(yàn)表明，兩茬紫花苜蓿均是隨著生育期的發(fā)展而增長(zhǎng)，SOD 酶活性呈先增長(zhǎng)后緩慢降低的趨勢(shì)，在分枝期達(dá)到最大值。在各個(gè)生育期內(nèi)，SOD 酶活性均是在TB 下達(dá)到最大值，其在紫花苜蓿生育后期活性降低的原因也跟MDA 酶含量增高有關(guān)系。同時(shí)，在兩茬紫花苜蓿中SOD 酶活性均在TB 下達(dá)最大值，這同樣說(shuō)明，在輕度水分脅迫下有利于增強(qiáng)SOD 酶的活性，提高紫花苜蓿的抗旱性。相反，在充分供水條件下，SOD 酶的活性則相對(duì)較低，這說(shuō)明在充分供水條件下不利于增強(qiáng)SOD 酶的活性。

過(guò)氧化氫酶（CAT）同樣也是植物體內(nèi)膜質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中主要的保護(hù)酶之一，它是最重要的抗氧化酶，CAT 可以催化兩個(gè)過(guò)氧化氫分子生成氧氣和水，從而保護(hù)膜系統(tǒng)[19-20]。在第一茬中，CAT 酶活性在前期增長(zhǎng)明顯，而在后期則趨于緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明在生育前期MDA 含量少，因此CAT 保護(hù)酶活性強(qiáng)，而后期因?yàn)镸DA 含量積累過(guò)多，抑制了CAT 酶的活性。在第一茬的各個(gè)時(shí)期內(nèi)，CAT 酶活性均在TB 狀態(tài)下達(dá)到最大值，這表明在中度水分脅迫下有利于CAT 酶活性的增強(qiáng)。在第二茬中，隨著生育期的發(fā)展，在紫花苜蓿生育后期CAT 酶活性有所降低，這與MDA 含量積累過(guò)高有關(guān)。隨著植物器官的衰老，各項(xiàng)生理機(jī)能的減弱，有關(guān)保護(hù)酶活性自然會(huì)降低。在第二茬的各個(gè)時(shí)期，CAT 酶活性在TB 下達(dá)到最大值，這說(shuō)明在輕度水分脅迫下有利于CAT 酶的活性，而在充分供水條件下CAT 酶含量有所降低，可能是因?yàn)檫^(guò)多的水分破壞了CAT 的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其活性降低。

總之，本次研究表明，隨著紫花苜蓿生育期的發(fā)展，MDA 酶含量逐漸增高。而3 種保護(hù)酶活性則呈現(xiàn)先增高后降低的變化。同時(shí)，在不同水分脅迫下，MDA 含量在TC 下達(dá)最大值，而3 種保護(hù)酶活性則在TB 下達(dá)到最大值。說(shuō)明MDA 酶和3 種保護(hù)酶之間相互影響，彼此制約；同樣表明紫花苜蓿有較強(qiáng)的抗旱性，在干旱地區(qū)種植該種植物，有利于促進(jìn)當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展。

3.2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)土壤水分脅迫對(duì)不同茬次紫花苜蓿丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響進(jìn)行研究。研究表明，隨著紫花苜蓿的生育期發(fā)展，丙二醛含量呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)（TC>TB>TA），且隨著土壤水分脅迫的加劇，丙二醛含量也呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。這說(shuō)明在逆境或衰老情況下，紫花苜蓿的丙二醛含量會(huì)增高。

同樣，隨著紫花苜蓿生育期的發(fā)展，3 種保護(hù)性抗氧化酶的活性呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，在分枝期達(dá)到最大值，且在各個(gè)時(shí)期，3 種保護(hù)性抗氧化酶的活性均在輕度水分脅迫（TB）下達(dá)到最大值，說(shuō)明輕度水分脅迫下有利于增強(qiáng)紫花苜蓿保護(hù)性酶的活性。這一結(jié)論也說(shuō)明，紫花苜蓿具有較強(qiáng)的抗氧化性和抗旱性，適合在干旱和半干旱地區(qū)種植，能夠發(fā)揮出其巨大的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。