葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌的誘變育種及發(fā)酵工藝優(yōu)化

趙芬芬，黃月榮，趙 輝，吳 靜，姜冬冬

1.鄭州黃河護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州源創(chuàng)基因科技有限公司，河南 鄭州 450000

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一種重要的工業(yè)酶制劑，其在有氧條件下能夠?qū)Ｒ坏貙ⅵ?D-葡萄糖氧化，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫和葡萄糖酸[1]。GOD 當(dāng)前被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域。目前可用于工業(yè)化生產(chǎn)GOD 的菌株共有30 多種，但大部分菌種都存在活化程度低、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)酶率低等問(wèn)題。因此，選育高活性的GOD 生產(chǎn)菌株，開發(fā)一種用于GOD 菌種活化生產(chǎn)的培養(yǎng)基，對(duì)于縮短發(fā)酵周期、提高產(chǎn)酶量、降低生產(chǎn)成本具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本文以桔青霉為生產(chǎn)菌株，對(duì)其進(jìn)行誘變處理，并設(shè)計(jì)了一種快速篩選高產(chǎn)菌株的方法，以農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)酶，對(duì)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的GOD 產(chǎn)量得到了明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桔青霉（Penicillium citrinum）CICC40277 購(gòu)買自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

培養(yǎng)基：

（1）孢子培養(yǎng)液（g/L）：Sucrose 30.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.012，K2HPO41.0，pH 為6.0～6.5。

（2）種子固體培養(yǎng)基：選定固液比為1∶1（W/V），取固體基質(zhì)（葡萄皮、香蕉皮、橘子皮、甘蔗渣、木薯葉、甜茶葉、麥麩）各5 g 置于250 mL 三角瓶中，分別加入5 mL 無(wú)機(jī)鹽溶液（Yeast powder 2.0、MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0，單位：g/L），pH為6.0～6.5，攪拌混勻。

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：Sucrose 30.0，Yeast powder 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO42.0，KCl 0.3，CaCO33.0，pH 為6.0～6.5，攪拌混勻。

（4）誘變篩選培養(yǎng)基：即添加有2-脫氧-D-葡萄糖（1 g/L）的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，加入0.001%（W/V）的甲基紅作為指示劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將購(gòu)買的菌株取出，加入40 mL 孢子培養(yǎng)液，洗脫至250 mL 三角瓶中。置于搖床上振蕩培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.2 種子固體發(fā)酵

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后接種孢子懸浮液，接種量為20%（V/V）。放置在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置為30 ℃。發(fā)酵結(jié)束后，向菌種固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入40mL pH 為7.0 的磷酸緩沖液。于30 ℃、200 r/min 的搖床上震蕩浸提1 h，所得浸提液即為種子培養(yǎng)液。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)固體培養(yǎng)基活化后的種子培養(yǎng)液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為20%（V/V），于30 ℃、200 r/min 的搖床上震蕩發(fā)酵培養(yǎng)12 h，離心后出取上清液，即得粗酶液。

1.2.4 高產(chǎn)GOD 菌株的誘變篩選

將經(jīng)過(guò)紫外誘變（紫外燈功率為30 W，照射距離為10 cm，照射時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、6 min）和微波輻射誘變（微波爐功率800 W，頻率2 450 MHz，處理時(shí)間分別為0、20、30、40、50、60 s）處理后的孢子懸浮液涂布在誘變篩選培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5 d 后，挑選形態(tài)較大、周圍變色圈較大的菌落進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其產(chǎn)酶能力。

1.2.5 種子固體培養(yǎng)基發(fā)酵條件的優(yōu)化

對(duì)固液比、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、接種量等方面進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1.2.6 種子固體培養(yǎng)基發(fā)酵組分的優(yōu)化

在已確定最適發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，研究不同的碳源、氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響。選用乳糖、蜂蜜、淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖分別作為碳源，添加量為5%（W/V），研究不同碳源對(duì)酶活力的影響。在確定最佳碳源后，再進(jìn)一步研究其濃度從1%～11%（W/V）對(duì)菌株產(chǎn)酶效率的影響。在此基礎(chǔ)上，選用NHCl、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NaNO3、Yeast powder 和蛋白胨分別作為氮源，添加量為0.5%（W/V），在確定最適氮源后，對(duì)其位于0.2%～1.2%（W/V）之間的最適濃度繼續(xù)進(jìn)行研究。

1.2.7 GOD 酶活力的測(cè)定

參照周建芹等[2]所建立的靛藍(lán)胭脂紅褪色分光光度法來(lái)測(cè)定GOD 的活力，公式如下：

式中：C 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的H2O2濃度變化值；V為反應(yīng)液體積（mL）；Df 為酶液稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時(shí)間（min）；Ve 為酶液體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種子培養(yǎng)方式對(duì)桔青霉產(chǎn)GOD 的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了固、液發(fā)酵兩種體系對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種發(fā)酵體系均可用于種子的活化培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)體系中，需要經(jīng)過(guò)120 h 的種子發(fā)酵培養(yǎng)，GOD 的酶活最高僅能達(dá)到24.96 U/g；而在固體發(fā)酵體系中，以木薯葉為固體基質(zhì)的種子培養(yǎng)基，僅需經(jīng)過(guò)96 h 的活化培養(yǎng)，GOD 的酶活就可達(dá)到最高值66.48 U/g。

2.2 誘變結(jié)果

經(jīng)紫外、微波誘變后篩選得到96 株耐受2-脫氧-D 葡萄糖的菌株，根據(jù)菌落周圍紅色圈的大小挑出44 株菌予以發(fā)酵培養(yǎng)，其中有9 株菌的酶活要高于原始菌株（66.48 U/g），而在這其中又屬Uv-7 號(hào)菌株的酶活最高，達(dá)到了79.76 U/g，與原始菌株相比酶活提高了20%。

2.3 P.citrinum Uv-7 產(chǎn)GOD 菌種固體發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)考察了不同固液比、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、接種量對(duì)菌種固體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，由圖1-（a）可知，當(dāng)固液比為1∶1（W/V）時(shí)，菌株產(chǎn)GOD 的酶活最高，達(dá)到73.84 U/g；當(dāng)接種量為20%（V/V）時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，GOD 的產(chǎn)量達(dá)到最大值77.76 U/g；經(jīng)過(guò)144 h 的恒溫固體培養(yǎng)活化后，GOD 的酶活力達(dá)到最大值78.96 U/g；當(dāng)鹽溶液的pH 為6.0 時(shí)，GOD 的產(chǎn)量達(dá)到最大值79.2 U/g；不同溫度下菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)出顯著差異，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值79.76 U/g。

圖1 菌種培養(yǎng)基發(fā)酵條件對(duì)葡萄糖氧化酶產(chǎn)量的影響

2.4 P.citrinum Uv-7 產(chǎn)葡萄糖氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)還研究了不同的碳源、氮源對(duì)菌株活化產(chǎn)GOD 的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-（b）所示。由圖可知，選用葡萄糖作為碳源時(shí)，GOD 的產(chǎn)量最高，達(dá)到91.76 U/g；當(dāng)葡萄糖的添加量為3%（W/V）時(shí)，酶活力達(dá)到最大值101.52 U/g。研究結(jié)果表明，只需額外添加少量的葡萄糖即可顯著提高葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量，這可能是因?yàn)槟臼砣~中所含有的糖類物質(zhì)已經(jīng)基本滿足了菌體對(duì)碳源的需求。

2.5 木薯葉菌種培養(yǎng)基成本核算

經(jīng)單因素優(yōu)化后得到木薯葉菌種培養(yǎng)基最優(yōu)輔料組分為：5.5 g 木薯葉，按照1∶1（W/V）的固液比添加鹽溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 0.5、Na2HPO42.0、KCl 0.3、CaCO33.0、葡萄糖30、酵母粉6，pH 為6.0。根據(jù)2022 年相關(guān)材料數(shù)據(jù)進(jìn)行核算，得出木薯葉菌種培養(yǎng)基成本僅需65.889 元/t。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)比較固、液培養(yǎng)對(duì)菌種生長(zhǎng)與產(chǎn)酶量的影響，確定了最優(yōu)菌種活化體系是以木薯葉為基質(zhì)，經(jīng)96 h 培養(yǎng)后，GOD 的活性達(dá)到66.48 U/g，與液體活化（24.96 U/g）相比提高了2.66 倍。然后采用單因素試驗(yàn)對(duì)P.citrinum Uv-7 菌株產(chǎn)GOD 的最佳菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)GOD 的活性從66.48 U/g 提高到了101.52 U/g，提高率為52.7%。廖兆民等[3]采用基因克隆的方式，將黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行共表達(dá)后對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，其GOD 酶活相比初始重組酵母提高了50.2%。而本研究經(jīng)菌種固體發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)菌種固體發(fā)酵培養(yǎng)后，僅需24 h 的液體發(fā)酵即可獲得較高的酶活，大大縮短了整體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，有利于節(jié)約工業(yè)化生產(chǎn)成本和時(shí)間。

對(duì)木薯葉菌種固體培養(yǎng)基進(jìn)行成本核算，得到其成本僅需65.889 元/t。張慶芳等[4]通過(guò)研究得到液體種子培養(yǎng)基組分為葡萄糖6%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.02%、MgSO4·7H2O 0.07%、KCl 0.05%、NaNO30.4%，pH 為7.0 時(shí)，按照同樣的標(biāo)準(zhǔn)核算后，其成本為134.032 元/t，而本研究的成本與之相比減少了68.143 元/t。

采用2-脫氧-D-葡萄糖為菌株抑制劑和甲基紅為指示劑建立了一種高效、簡(jiǎn)便的篩選方法。2-脫氧-D-葡萄糖可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但對(duì)產(chǎn)GOD菌株的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用[5]。GOD 能夠使葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸，從而使培養(yǎng)基的酸性增強(qiáng)。本研究以甲基紅為指示劑，通過(guò)顯色圈的大小可以快速的篩選出高產(chǎn)GOD 的菌株，該試劑安全、低毒、經(jīng)濟(jì)，高效。

本研究結(jié)果為葡萄糖氧化酶的安全工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。證明了固體發(fā)酵不僅能使生產(chǎn)成本有所降低，而且能使菌株產(chǎn)酶性能也明顯提高。

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，利用農(nóng)業(yè)廢棄物為基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)酶等副產(chǎn)品，可實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益的同步提升。