無芒雀麥和燕麥種子萌發(fā)過程中葉綠體光合變化

田沛鑫,宋 瑞,李超然,倪浩然,王 潤,劉 萍,張 涵,毛培勝,賈善剛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京100193)

光合作用是植物通過光反應(yīng)和暗反應(yīng)兩個階段,將太陽光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能,以維持植物生長發(fā)育的重要生物過程[1]。葉綠體是高等植物進行光合作用的場所,由葉綠體雙層被膜、葉綠體基質(zhì)和類囊體構(gòu)成。種子萌發(fā)是植物生命周期的起點,種子從土壤中萌發(fā)到破土的過程,伴隨著葉綠體從前質(zhì)體到黃化質(zhì)體,再到成熟葉綠體3個發(fā)育階段[2]。高等植物葉綠體的生物發(fā)生過程中伴隨著各種生理生化的變化,如光合色素的含量變化。光合色素位于葉綠體類囊體膜上,主要分為葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽素三大類[3-4]。其中,在植物細胞對光能的捕捉過程中,葉綠素起主要作用,類胡蘿卜素(包括胡蘿卜素和葉黃素)和藻膽素則是對葉綠素捕獲光能的補充,又被稱為輔助色素。光合色素含量的高低代表著植物的光合能力,在一定程度上也代表著植物生長發(fā)育的狀態(tài)[5]。此外,葉綠素具有熒光現(xiàn)象,其熒光強弱與光合作用碳同化存在相關(guān)性,可以作為光合作用研究的重要指標[6]。葉綠素?zé)晒鈨x基于葉綠素?zé)晒庑?yīng),可用于測定植物光合熒光參數(shù),包括：暗適應(yīng)下最小熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、光適應(yīng)下PSII反應(yīng)中心的實際光化學(xué)效率(ФPSII)、電子傳遞效率(Electron translate ratio,ETR)等[7-8]。

多光譜成像技術(shù)(Multispectral imaging,MSI)是一種表型組學(xué)研究工具,采用了LED濾波技術(shù),組合測量多達20個不同波長并集成到1張高分辨光譜圖像中。VideometerLab4是常用的光譜成像設(shè)備,集成了照明、相機以及計算機技術(shù),具有數(shù)字圖像分析以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計能力,用于快速、有效測定生物材料表面顏色、質(zhì)構(gòu)、化學(xué)組分等[9-12]。該儀器可將植物內(nèi)在特征轉(zhuǎn)換為不同的光譜信息,結(jié)合標準化典型判別分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)、線性判別分析、偏最小二乘判別分析和隨機森林等數(shù)學(xué)多元分析模型等,鑒定樣品之間的差異[11]。近年來,隨著多光譜成像技術(shù)的發(fā)展,MSI技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于植物和種子的表型及生理分析。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)表型組學(xué)研究結(jié)果表明,MSI技術(shù)能夠高準確度識別和鑒定牧草種子的形態(tài)特征、判定種子的發(fā)芽率和生活力等質(zhì)量指標[13-15]。Pan等研究成果表明多光譜成像可實現(xiàn)葉綠素a、b含量的無損鑒定[16]。因此,利用多光譜技術(shù)快速無損地分析植物表型、關(guān)聯(lián)研究植物生理生化指標的變化規(guī)律與響應(yīng)特性,具有較高的應(yīng)用前景。

葉綠體是光合作用主要場所,種子萌發(fā)過程中胚芽葉綠體的發(fā)育狀態(tài)對植株生長活力、結(jié)實和生物產(chǎn)量極其重要[17]。目前葉綠體發(fā)育相關(guān)研究多集中在模式植物擬南芥中,且對葉片葉綠體的關(guān)注較高,針對禾本科牧草胚芽葉綠體的研究極少。無芒雀麥(BromusinermisLeyss.)是一種多年生的禾本科草本植物,具有較強的抗旱、抗寒性[18-19]。無芒雀麥營養(yǎng)成分豐富,適口性好,家畜喜食,是一種優(yōu)質(zhì)牧草[20]。燕麥(AvenasativaL.)為一年生禾本科植物,作為一種古老的糧食作物,具有高蛋白、低碳水化合物等特點[21]。燕麥不但可以作為糧食作物,其籽實作為優(yōu)質(zhì)飼料還可用于飼喂雞、豬等家畜家禽[22-24]。因此,了解兩種不同的多年生禾本科牧草種子在萌發(fā)過程中胚芽葉綠體的發(fā)育,對提高牧草光合潛力和產(chǎn)量具有重要意義。本研究以無芒雀麥和燕麥為研究材料,通過模擬種子從黑暗土壤中破土并在光照下生長的過程,測定胚芽出土后光合色素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標,分析兩種試驗材料在萌發(fā)過程中的表型變化,探究無芒雀麥和燕麥種子萌發(fā)過程中葉綠體光合變化和生物發(fā)生過程,為葉綠素?zé)晒夂投喙庾V成像技術(shù)在牧草種子萌發(fā)過程中葉綠體光合變化的相關(guān)研究中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的無芒雀麥品種為‘原野’,在2021年于河北承德市國營魚兒山牧場基地收獲。燕麥品種為‘挑戰(zhàn)者’,購買于BrettYoung公司,源于加拿大。無芒雀麥和燕麥種子發(fā)芽率分別為94%和99%,發(fā)芽勢為86%和92%,于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子生理與生產(chǎn)實驗室貯藏6個月,貯藏溫度為25℃,濕度35%。

1.2 試驗設(shè)計

對無芒雀麥和燕麥種子進行出土預(yù)試驗,土壤基質(zhì)配比為營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1,種子播種于花盆內(nèi)(直徑26 cm,高度23.5 cm),播種深度為2.5 cm,花盆放置于人工氣候培養(yǎng)室。預(yù)試驗結(jié)果表明,無芒雀麥和燕麥種子出土所需的時間分別是6天和5天,此結(jié)果用于后續(xù)的遮光處理。

采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法,在10個方形培養(yǎng)皿(11.5 cm×11.5 cm)中放置3層濾紙作為種床,每個培養(yǎng)皿中放置50粒大小均勻一致的種子,將擺放好種子的培養(yǎng)皿分為兩組。為模擬種子胚芽出土前的黑暗生長條件,用錫紙將培養(yǎng)皿包裹兩層進行遮光處理,遮光時間按照預(yù)試驗中胚芽出土?xí)r間設(shè)置,遮光結(jié)束后揭開錫紙,代表種子出土,在光照8 h,黑暗16 h的光周期下繼續(xù)培養(yǎng)。光照第1天(E0h～E8h)每隔一定時間進行試驗測定,光照第2天到光照第4天(E2d～E4d)在上午10點和下午6點進行測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1發(fā)芽指標的測定 各取100粒大小均勻一致的無芒雀麥和燕麥種子,放置于方形培養(yǎng)皿(11.5 cm×11.5 cm)中,加入3層濾紙作為種床,用移液槍注入10 mL去離子水將濾紙濕潤,置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個處理設(shè)置4個重復(fù)。培養(yǎng)期間每天于固定時間點對發(fā)芽種子數(shù)進行統(tǒng)計,并根據(jù)規(guī)定計算種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。

(1)

(2)

1.3.2多光譜成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集 使用VideometerLab光譜成像設(shè)備,組合測量多個不同波長并集成到1張高分辨光譜圖像中,進行兩種試驗材料在萌發(fā)過程中的表型變化判定分析,對拍攝所得到的圖像進行歸一化典型判別分析(nCDA)、灰度圖分析和RGB分析。采集多光譜數(shù)據(jù)之前,需要針對不同光譜特征的種子,對指定樣品的光譜信息進行標準化,對不同光譜強度的感興趣區(qū)域進行標記和著色。本研究分別使用紅色和藍色對初始和最終的幼苗MSI圖像進行標準化,其他圖像采用Videometer軟件version 4中MSI-transformation Builder的nCDA函數(shù)進行相應(yīng)的轉(zhuǎn)換[8]。

1.3.3種子萌發(fā)過程中光合色素含量的測定 揭開錫紙后以隨機重復(fù)的方式收集無芒雀麥胚芽,稱重記錄,設(shè)置3個重復(fù)。將胚芽剪成細絲轉(zhuǎn)移到2 mL的試管中,加入1.5 mL濃度80%丙酮,在遮光、室溫(22℃)條件下過夜浸提,直到胚芽完全變白。以80%丙酮為空白樣品,使用分光光度計測定663 nm,645 nm和470 nm處的吸光度值[25-27]。根據(jù)以下公式計算葉綠素和類胡蘿卜素的濃度：

葉綠素濃度=葉綠素a+葉綠素b

=(12.21×A663-2.81×A645)+(20.13×A645-5.03×A663)

=7.18×A633+17.32×A645

類胡蘿卜素濃度=(1000×A470-3.27×Ca-104×Cb)÷229

光合色素含量(mg·g-1)=C(mg·L-1)×提取液總量(mL)/稃片重量(g)×1000

式中,Ca為葉綠素a濃度;Cb為葉綠素b濃度。A663,A645和A470分別為葉綠體色素提取液在波長663 nm,645 nm和470 nm下的吸光度。

1.3.4葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 使用FMS-2便攜脈沖調(diào)制式熒光儀對無芒雀麥的胚芽葉綠體熒光參數(shù)進行測定,隨機重復(fù)3次進行試驗。由于胚芽過于纖細,故需要將多個胚芽無間隙地擺放在一起進行測定,測量部位統(tǒng)一位于胚芽的中上部。在測定過程中先進行光適應(yīng)參數(shù)(Fs,Fm′,Fo′,Fv′,Fv′/Fm′,ФPSII,ETR)的測定,待經(jīng)過20 min的遮光處理后再進行暗適應(yīng)參數(shù)(Fo,Fm,Fv,Fv/Fm)的測定[28-29]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理和計算,借助軟件GraphPad Prism 8對試驗結(jié)果進行作圖分析,所有結(jié)果用“均值±標準差(mean±SD)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 無芒雀麥和燕麥胚芽的多光譜圖像分析

通過nCDA圖、RGB圖和灰度圖的分析,無芒雀麥胚芽在照光后,在E0h,E2h,E3hE4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d表型存在劇烈的變化(圖1a)。隨著光照的時間的延長,無芒雀麥胚芽表型由黃變綠,nCDA圖由藍色變黃,最后變?yōu)榧t色。

隨著光照時間的延長,燕麥胚芽表型由黃變綠,nCDA圖由藍色向紅色轉(zhuǎn)變,變化較為劇烈的時間節(jié)點分別為E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d(圖1b)。

2.2 無芒雀麥種子萌發(fā)胚芽生理生化變化

2.2.1無芒雀麥種子萌發(fā)過程中光合色素的變化 如圖2所示,在經(jīng)過為期5天的光照后,葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均增加。在胚芽見光的第1天,即從E0h—E8h時間段內(nèi)葉綠素a和葉綠素b含量接近于0,在E2.5h含量略微上升,在E1d開始迅速積累,類胡蘿卜素在E8h時達到較高值,在E1d時迅速下降后又迅速上升。葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素在第5天時的含量分別達到了第1天含量的9.322,12.311,3.412和1.813倍。

圖1 揭開錫紙前3天無芒雀麥(a)和燕麥(b)胚芽的多光譜nCDA圖Fig.1 MSI nCDA images of plumule during the first 3 days after being exposed to light in smooth bromegrass (Panel a) and oat (Panel b)

2.2.2無芒雀麥種子萌發(fā)過程中葉綠體熒光參數(shù)的變化 通過測定無芒雀麥暗適應(yīng)下葉綠體熒光參數(shù)發(fā)現(xiàn),各項指標隨種子萌發(fā)時間延長均呈現(xiàn)上升趨勢,初始熒光產(chǎn)量Fo、最大熒光產(chǎn)量Fm呈現(xiàn)出相似的變化趨勢,在E0h—E8h呈上升趨勢,在E1 d大幅度下降。PSII最大光學(xué)效率Fv/Fm在E0h—E1h略微下降,E1h—E1d迅速上升,E1d后數(shù)值趨于穩(wěn)定(圖3)。光適應(yīng)參數(shù)Fs,Fo′,Fv′,Fm′與暗適應(yīng)變化規(guī)律相似,在E1d時下降到較低點,隨后進入快速上升階段,E4d時達到P值。PSII有效光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv′/Fm′與Fv/Fm變化趨勢相似,Fv′/Fm′以E2.5h為轉(zhuǎn)折點,在E2.5h—E1d時間段內(nèi)Fv′/Fm′逐漸上升后穩(wěn)定。暗適應(yīng)下的初始熒光產(chǎn)量、最大熒光產(chǎn)量均高于光適應(yīng)時期數(shù)值。PSII實際光化學(xué)效率ФPSII和PSII電子傳遞速率ETR變化趨勢與Fv/Fm和Fv′/Fm′相似,在E40min出現(xiàn)下降,在E1h—E1d數(shù)值波動變化(圖4)。

圖3 無芒雀麥暗適應(yīng)葉綠體熒光參數(shù)Fig.3 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in smooth bromegrass

圖4 無芒雀麥光適應(yīng)葉綠體熒光參數(shù)Fig.4 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in smooth bromegrass

2.3 燕麥種子萌發(fā)胚芽生理生化變化

2.3.1燕麥種子萌發(fā)過程中光合色素的變化 由圖5所示,燕麥幼苗葉綠體光合色素含量總體呈現(xiàn)出與無芒雀麥相同的上升趨勢,其中葉綠素a和葉綠素b在E1h時基本未合成,在E2.5h后含量開始上升,主要在E1d—E5d期間合成,葉綠素含量在E1d下降到較低點后,含量迅速增加。類胡蘿卜素的初始含量為0.02 mg·g-1,在黑暗下正常合成,在E8h達到較高點,在E1d迅速下降后又上升,此后穩(wěn)定在較高水平。

圖5 燕麥光合色素含量變化Fig.5 Photosynthetic pigment content of oat

2.3.2燕麥種子萌發(fā)過程中葉綠體熒光參數(shù)的變化 燕麥的暗適應(yīng)和光適應(yīng)各項指標整體上均呈現(xiàn)上升趨勢。其中,暗適應(yīng)參數(shù)Fo,Fm,Fv變化趨勢相似,在E0h—E1d都沒有發(fā)生顯著變化,E1d之后數(shù)值急速增加達到最大值,E4d和E5d數(shù)值均在峰值上下波動。Fv/Fm整體呈現(xiàn)上升趨勢,在光照40 min時明顯上升,達到最大值,隨后在E1h迅速下降,E1h—E1d逐漸上升,E1d后趨于穩(wěn)定(圖6)。與暗適應(yīng)下的光合參數(shù)相比,光適應(yīng)下的熒光參數(shù)Fs,Fo′,Fm′,Fv′表現(xiàn)出相同趨勢的變化特征,在E1d時發(fā)生輕微下降,E1d后數(shù)值迅速增加。Fv′/Fm′與Fv/Fm響應(yīng)曲線相似,在E40min時出現(xiàn)峰值,隨后在E1h時迅速下降,在E1h—E2d逐漸上升,隨后趨于平緩。ФPSII和ETR在E1h時數(shù)值下降到原本的1/4,此后持續(xù)回升,在上下波動中趨于穩(wěn)定(圖7)。

圖6 燕麥暗適應(yīng)葉綠體熒光參數(shù)Fig.6 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in oat

圖7 燕麥光適應(yīng)葉綠體熒光參數(shù)Fig.7 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in oat

3 討論

多光譜成像技術(shù)可以快速、無損獲取不同發(fā)育狀態(tài)的種子、幼苗組織和幼苗等的光譜和形態(tài)信息,在植物幼苗光合相關(guān)生理指標表型分析研究中具有強大的應(yīng)用前景。nCDA分析可以有效鑒別不同生理狀態(tài)的植株或種子狀態(tài)的差異,如判別不同活力的多年生黑麥草(Loliumperenne)種子[30]、區(qū)分老化和未老化的豇豆(Vignaunguiculata)種子[31]等。在本試驗中,我們通過nCDA模式下胚芽圖片顏色的變化,識別出了無芒雀麥和燕麥種子萌發(fā)不同時間下胚芽發(fā)育狀態(tài)的差異,發(fā)現(xiàn)了無芒雀麥胚芽快速發(fā)育的時間節(jié)點E0h,E2h,E3h,E4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d,燕麥胚芽快速發(fā)育的時間節(jié)點E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d,在一定程度上可以反映無芒雀麥和燕麥幼苗的光合響應(yīng)特征。

無芒雀麥和燕麥是通過色素蛋白復(fù)合體對光能進行捕捉從而來進行光合作用的,幼苗光合色素含量直接反映了植物葉片光合能力的大小[5],光合色素的含量的變化可以反映出幼苗的生理情況[32-34]。本試驗在揭開錫紙后對種子萌發(fā)過程中光合色素含量進行測定,發(fā)現(xiàn)葉綠素a和葉綠素b的初始含量均接近于0,在光照條件下隨著萌發(fā)時間的延長,無芒雀麥和燕麥幼苗中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量在總體上呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢[35]。值得注意的是,無芒雀麥和燕麥光合色素含量表現(xiàn)出相同的響應(yīng)規(guī)律,葉綠素a和葉綠素b在E1d后含量迅速上升,類胡蘿卜素含量在E1d時發(fā)生小幅度下降后升高。葉綠素含量與植物對外界光照強度適應(yīng)能力密切相關(guān)[36],種子感光性主要受光敏色素的調(diào)控[37],因此推斷胚芽在揭開錫紙后1 h內(nèi)對光照的適應(yīng)能力較弱,主要在合成光敏色素響應(yīng)光信號,可能導(dǎo)致了葉綠素含量在E0h—E1h期間含量低。類胡蘿卜素是對葉綠素捕獲光能的補充,又被稱為輔助色素,是葉綠體內(nèi)重要的非酶促抗氧化系統(tǒng)[38],類胡蘿卜素含量在E1d時出現(xiàn)下降,可能與葉綠體內(nèi)光保護機制有關(guān)[39-40]。

葉綠素?zé)晒饪梢詫夂献饔眠M行準確而有效的反映,可以表現(xiàn)出PSII反應(yīng)中心的活性和植物光合作用的強弱。Fo反映植物光能利用能力,Fm反映植物光合活性大小[41]。本試驗中Fo和Fm在E1d之前保持較低的水平,E1d之后數(shù)值上升,呈現(xiàn)上下波動的狀態(tài),說明光反應(yīng)中心在E1d前保持較高的活性,胚芽的光能利用能力逐漸增強。Fv/Fm反映了光反應(yīng)中心PSII的最大光能轉(zhuǎn)換效率,無芒雀麥和燕麥Fv/Fm和Fv′/Fm′變化規(guī)律整體相似。植物在非脅迫環(huán)境下,Fv/Fm穩(wěn)定在0.80～0.85,低于0.75可認為植物受到了光抑制[42]。光照前期無芒雀麥和燕麥的Fv/Fm均低于正常值,在光照一定時間后恢復(fù)正常值,說明在暗適應(yīng)下,幼苗的光化學(xué)反應(yīng)過程受到了一定程度的抑制。在光適應(yīng)下,無芒雀麥和燕麥的Fv′/Fm′值均呈現(xiàn)下降后上升的趨勢。無芒雀麥Fv/Fm在E1h—E1d數(shù)值迅速上升,Fv′/Fm′值在E2.5h—E1d逐漸上升,E1d后趨于穩(wěn)定。燕麥Fv/Fm和Fv′/Fm′主要在E1h—E1d期間逐漸上升,E1d后不再大幅度增加。ФPSII和ETR均可作為評價植物實際光化學(xué)效率的指標,本研究中ФPSII和ETR整體呈穩(wěn)定狀態(tài),無芒雀麥ФPSII和ETR在E40min時呈現(xiàn)下降趨勢,燕麥ФPSII和ETR在E1h時出現(xiàn)大幅度下降。綜上所述,無芒雀麥和燕麥在E1h—E1d期間,光合色素含量和PSII反應(yīng)中心活性迅速增加,因此E1h—E1d可被看作是葉綠體發(fā)育的主要階段,在E1d之后光合色素和葉綠體熒光參數(shù)趨于穩(wěn)定,意味著葉綠體發(fā)育基本成熟,能夠進行正常的光合作用。

4 結(jié)論

本試驗利用多光譜和nCDA分析,鑒別出無芒雀麥和燕麥種子在萌發(fā)過程中不同時間節(jié)點發(fā)育狀態(tài)的差異,并獲取了胚芽表型發(fā)生變化的關(guān)鍵時間節(jié)點(揭開錫紙1～2小時),這與胚芽內(nèi)光合色素含量的變化具有相關(guān)性。隨著萌發(fā)時間的延長,無芒雀麥和燕麥種子萌發(fā)過程中光合色素含量逐漸積累,葉綠素a和葉綠素b在E1h之前未發(fā)生合成,E1h—E1d為葉綠素的快速積累階段。PSII反應(yīng)中心活性在E1h—2.5h開始變化,直到E1d后趨于穩(wěn)定,在此期間葉綠體逐漸發(fā)育,PSII反應(yīng)中心活性迅速增加,E1d后葉綠體結(jié)構(gòu)基本發(fā)育完全。