硫化氫通過激活A(yù)TP敏感性鉀通道保護(hù)小鼠在體缺血損傷視網(wǎng)膜和原代缺氧視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞*

張玉娥， 張 君， 高秀娟， 張 迪， 莊金珠， 孫 暉△， 蘇 云

（1濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2濱州職業(yè)學(xué)院，山東 濱州 256603；3煙臺(tái)中心血站，山東 煙臺(tái) 264030）

視網(wǎng)膜缺氧是導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells， RGCs）損傷和死亡的主要原因，并可使患者致盲［1］，很多眼科疾?。ㄈ缜喙庋?、糖尿病視網(wǎng)膜病變等）都可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧［2］。缺氧損傷的RGCs 可以觀察到典型的鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞凋亡［3］。視網(wǎng)膜缺氧也可觀察到視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層變薄，RGCs層細(xì)胞凋亡增加，隨時(shí)間延長RGCs 密度也降低［4］。因此，在視神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷過程中，如何避免視網(wǎng)膜缺血特別是RGCs損傷一直是研究的熱點(diǎn)問題。

在腦神經(jīng)元缺血和興奮性中毒損傷的保護(hù)作用中，ATP 敏感性鉀通道（ATP-sensitive potassium channel， KATP通道）都發(fā)揮重要作用［5］，而RGCs 上存在KATP通道［6］。KATP通道是一種對細(xì)胞內(nèi)ATP 和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate， ADP）濃度非常敏感的離子通道［7］。低氧可導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)ATP 濃度降低，而KATP通道可在ADP/ATP 比值增高時(shí)激活，并導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，使其谷氨酸釋放減少［8］。敲除KATP通道的Kir6.2亞基可增加缺血性梗死，而過表達(dá)Kir6.2亞基可減少缺血性損傷引起的神經(jīng)元損傷［8］，而KATP通道開放劑能夠保護(hù)興奮性中毒導(dǎo)致的RGCs損傷［9］，這些結(jié)果都提示KATP通道可作為減輕缺血導(dǎo)致視網(wǎng)膜（包括RGCs）損傷的重要靶點(diǎn)。

硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）作為一種氣體遞質(zhì)，其對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用逐漸被關(guān)注［10］，H2S 預(yù)處理可減輕缺血缺氧導(dǎo)致的RGCs 凋亡［11］，也可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活化，減輕視網(wǎng)膜炎癥起到神經(jīng)保護(hù)作用［12］，而且H2S 還可通過激活KATP通道抑制氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞損傷［13］。但是，硫化氫是否可通過激活KATP通道減輕小鼠離體及在體缺血缺氧導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷還未見報(bào)道。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J 雄性0~3 日齡小鼠150只，8 周齡小鼠100 只，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，SPF 級動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。許可證號為SCXK（魯）2022-0006。所有實(shí)驗(yàn)符合濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2 主要試劑 抗OX-41 抗體（NB100-65530，Novus Biologicals）；抗鼠Thy1.1 單克隆抗體（MAB1406，Millipore）；硫氫化鈉（NaHS； 13590，Sigma）；格列本脲（glibenclamide； G06309，Sigma）；吡那地爾（pinacidil；P154，Sigma）；抗cleaved caspase-3 抗體（9661，CST）；抗β-tubilin 抗體（AT819，Beyotime）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）檢測試劑盒（Promega）。

1.3 主要儀器設(shè)備 共聚焦顯微鏡（TCS SP8 CARS，Leica）；膜片鉗信號放大系統(tǒng)（700B，Axon）；紅外成像系統(tǒng)（Odyssey Li-Cor）。

2 方法

2.1 原代RGCs 培養(yǎng) 新生小鼠采用氯胺酮（50 mg/kg）麻醉，取眼球置于Eagle 氏液（Eagle's buffer solution， EBS）中，RGCs 通 過 兩 步 酶 法 消 化和 純化［14-15］。取出視網(wǎng)膜置于37 ℃含酶的EBS 中（木瓜蛋白酶1.5×104U/L；膠原酶7.0×104U/L；胎牛血清0.2 g/L；DL-半胱氨酸0.2 g/L）30 min。然后，置于含0.004% DNA 酶、1 g/L 胎牛血清和2 μg/L 卵清蛋白的EBS 中吹散。細(xì)胞懸液1 500×g離心10 min，細(xì)胞重懸于含0.1% BSA 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution， PBS）中。重懸細(xì)胞液孵育于含抗OX-41抗體包被的燒瓶中30 min 使細(xì)胞膜上有OX-41 抗原的細(xì)胞貼壁。將剩余細(xì)胞懸液置于含抗鼠Thy1.1單克隆抗體（OX-7，1∶150，RGCs 特異標(biāo)記）包被培養(yǎng)皿中，然后用DMEM/F12 培養(yǎng)液將貼附在培養(yǎng)皿上的細(xì)胞沖洗下來。將含純化細(xì)胞的DMEM/培養(yǎng)液1 500×g離心10 min，細(xì)胞置于含2% B27 的Neurobasal培養(yǎng)液中重懸。將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞爬片貼壁1 h（置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱），補(bǔ)1.5 mL 含2 % B27 的Neurobasal 培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d 備用。純化8 d 的原代RGCs 利用Thy1.1 抗體染色，純化率90%以上符合要求［16］。

2.2 缺氧損傷RGCs 模型制備 （1）離體缺氧RGCs模型制備。本實(shí)驗(yàn)利用OGD 方法制備離體細(xì)胞缺氧［17］，具體如下：OGD 實(shí)驗(yàn)要求原代RGCs 細(xì)胞密度≥10 000個(gè)/10 mm2，培養(yǎng)時(shí)間8 d。首先原代RGCs在無鎂無糖EBS 中沖洗3 次，然后置于無糖無鎂無氧EBS液中孵育于厭氧培養(yǎng)箱（5% CO2，95% N2，37 ℃）中90 min。培養(yǎng)RGCs 用正常EBS 沖洗3 次，在普通培養(yǎng)箱（5% CO2，95% O2，37 ℃）孵育24 h。（2）在體缺氧損傷RGCs 模型制備。采用本課題組此前研究使用模型［5］，具體如下：采用滑輪-縫線系統(tǒng)使小鼠一側(cè)眼內(nèi)壓升高，另一側(cè)做對照。將70 cm 外科縫線（4/0）兩端各系一相同重量砝碼，縫線中間系一圓圈環(huán)繞眼角鞏膜緣后1 mm，兩端25 g 砝碼分別通過一組滑輪對眼球穩(wěn)定施壓60 min。TonoLab 眼壓計(jì)檢測眼內(nèi)壓升高至14.63 kPa，眼底鏡見視網(wǎng)膜變白，提示視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈壓迫血流減少。

2.3 鈣成像 RGCs 內(nèi)鈣離子用Fluo-4 AM 標(biāo)記并用共聚焦顯微鏡觀察其變化。首先用EBS 沖洗原代RGCs 2 次，含F(xiàn)luo-4 AM（4 mmol/L）的EBS 孵育60 min。然后將RGCs 置于正常EBS 中30 min，置于倒置共聚焦顯微鏡下15 min。采用63 倍油鏡488 nm激發(fā)，530 nm 接收。開始5 min 熒光為基準(zhǔn)值，觀察其后不同藥物處理30 min 的熒光變化。熒光強(qiáng)度利用動(dòng)態(tài)采集分析程序完成。為平衡熒光衰減，用Ft/F0相對熒光強(qiáng)度值表示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化（Ft表示每個(gè)細(xì)胞在單個(gè)時(shí)點(diǎn)熒光強(qiáng)度平均值，F(xiàn)0表示開始5 min 相同細(xì)胞熒光強(qiáng)度平均值減去背景熒光強(qiáng)度值，背景熒光強(qiáng)度指除細(xì)胞外隨機(jī)區(qū)域熒光強(qiáng)度平均值）。

2.4 細(xì)胞死亡率 細(xì)胞處理24 h 后加入Hoechst 33258于37 ℃孵育25 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，細(xì)胞核固縮或破碎可認(rèn)定為死亡，細(xì)胞死亡率（%）=每個(gè)視野死亡細(xì)胞數(shù)/所有細(xì)胞數(shù)×100 %，整個(gè)過程采用雙盲法計(jì)數(shù)。

2.5 細(xì)胞活性 RGCs活性利用其培養(yǎng)液中LDH 釋放量來確定，細(xì)胞處理24 h后收集培養(yǎng)液，用LDH檢測試劑盒進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀檢測其吸光度（A）值。

2.6 Western blot 不同藥物處理的原代RGCs培養(yǎng)24 h 后置于含蛋白酶抑制劑的1% SDS 中，12 000×g低溫離心30 min。行10% SDS-PAGE 分離蛋白樣本（40 mg）1.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h。硝酸纖維素膜封閉1 h，加入Ⅰ抗（cleaved caspase-3 抗體，1∶1 000；β-tubulin 抗體，1∶10 000）4 ℃孵育12 h。Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 沖洗3 次，每次10 min。凝膠成像儀成像，條帶灰度用ImageJ軟件分析。

2.7 膜片鉗記錄 膜片鉗記錄原代RGCs，培養(yǎng)8 d備用。其中電極內(nèi)液成分為：155 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES， 2 mmol/L MgATP，0.3 mmol/L NaGTP（pH 7.2）；電極外液成分為：150 mmol/L NaCl，2 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.5 mmol/L CaCl2，10 mmol/L glucose，10 mmol/L HEPES（pH 7.4，280~290 mOsm）。鉀通道電流主要用電壓鉗模式記錄，首先將細(xì)胞膜電位鉗制于-80 mV，然后將膜電位鉗制由-140 mV 開始，階躍提升20 mV，至+80 mV 停止。鉗制電位0.8 s，5 s 提升一次。膜電位和膜興奮性在電流鉗模式下給予0 pA電流和200 pA電流觀察。

2.8 玻璃體腔注射 眼球施壓結(jié)束后，立即進(jìn)行玻璃體腔藥物注射［5］。眼球滴加阿托品擴(kuò)瞳后，顯微鏡下10 μL微量注射器于角鞏膜緣后1 mm的鞏膜處平行角鞏膜緣刺入玻璃體腔，推入NaHS 或KATP通道激動(dòng)劑pinacidil 或（和）KATP通道阻斷劑glibenclamide溶液5 μL或等體積溶劑。

2.9 形態(tài)學(xué)檢測 在體缺血模型建立后28 d 處死小鼠，取出眼球置于4%多聚甲醛中固定過夜，常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色，中性樹膠封片，觀察測量各項(xiàng)指標(biāo)均在視乳頭旁0.5 mm 進(jìn)行觀察、拍片。測量指標(biāo)包括：（1）RGC層-外核層（RGC layer-outer nuclear layer， GCL-ONL）厚度；（2）內(nèi)叢狀層（inner plexiform layer， IPL）厚度；（3）內(nèi)核層（inner nuclear layer， INL）厚度；（4）外核層（outer nuclear layer， ONL）厚度；（5）GCL 范圍內(nèi)細(xì)胞密度（細(xì)胞數(shù)量/160 μm視網(wǎng)膜長度）。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。當(dāng)多組間進(jìn)行比較時(shí)，采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)），兩組數(shù)據(jù)比較采用雙尾t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NaHS可減輕OGD導(dǎo)致的離體原代RGCs損傷

Hoechst 33258 染色觀察NaHS 減輕OGD 導(dǎo)致的原代RGCs損傷，OGD處理原代RGCs 90 min，細(xì)胞死亡率增加到70.3%±7.5%，主要表現(xiàn)為核濃縮，核碎裂和細(xì)胞收縮（圖1A、B）。不同濃度NaHS 溶液處理OGD損傷的RGCs，10和30 μmol/L NaHS組細(xì)胞死亡率分別為52.3%±5.7%和40.3%±5.5%，顯著高于vehicle 組（13.5%±2.3%和11.2%±3.3%，P<0.01），100 和300 μmol/L NaHS 可將細(xì)胞死亡率降低至23.1%±6.2%和17.3%±4.3%，與vehilce 組無顯著差異（P>0.05），此濃度NaHS未見細(xì)胞毒性作用。另外，還觀察了培養(yǎng)液中LDH變化評估細(xì)胞活性，結(jié)果顯示與vehicle 組（1.0±0.1）相比，OGD 處理RGCs 培養(yǎng)液中LDH 濃度顯著升高（4.3±0.4，P<0.01），100和300 μmol/L NaHS 也可降低OGD 導(dǎo)致的LDH 濃度升高，與vehicle 組相比沒有顯著差別（1.5±0.3 和1.3±0.2，P>0.05），見圖1C。

Figure 1.NaHS decreased the cell death rate of primary RGCs subjected to OGD.A： Hoechst 33258 staining of RGCs treated with NaHS and OGD， OGD caused obvious nuclear pyknosis in primary RGCs， while the proportion of nuclear pyknosis was significantly reduced after treatment with 100 and 300 μmol/L NaHS.The arrows indicate typical pyknotic nuclei.B： quantitative analysis of RGCs cell death rate after treatment with NaHS and OGD； C： LDH release of RGCs treated with NaHS and OGD.Mean±SEM.n=8.**P<0.01 vs vehicle group.圖1 NaHS在OGD導(dǎo)致原代RGCs損傷中的作用

2 NaHS 對OGD 導(dǎo)致原代RGCs 損傷保護(hù)的時(shí)間依賴性

首先，OGD 處理后RGCs 在12 h 后開始出現(xiàn)死亡，到24 h 死亡率進(jìn)一步升高（圖2A）。在給予OGD處理同時(shí)給予NaHS（300 μmol/L）可使細(xì)胞死亡開始的時(shí)間延長到OGD 處理20 h 開始升高（28.7%±3.3%，P<0.05），到24 h 的細(xì)胞死亡率僅升高到31.9%±5.2%（P<0.05），細(xì)胞死亡率較OGD 組顯著降低（P<0.01，圖2A）。此外，先給予NaHS 預(yù)處理，再給予OGD后14 h（圖示-10 h）可觀察到細(xì)胞死亡率（40.0%±5.2%）開 始 低 于OGD 對 照 組（76.4%±5.7%，P<0.01），直到OGD 處理后24 h（圖示0 h）細(xì)胞 死 亡 率（25.6%±3.3%）仍 顯 著 低 于OGD 組（82.0%±5.5%，P<0.01）（圖2B）。最后，還觀察了NaHS 后處理對OGD 導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的影響，在圖2C 中可以看到OGD 后0、2、4 和6 h 給予NaHS 處理也可降低細(xì)胞死亡率（P<0.01），但是OGD后8、10和12 h給予NaHS后處理，其細(xì)胞死亡率和OGD組沒有差別（圖2C）。

Figure 2.NaHS time course in the medium and its protective effect on RGCs injured by OGD.A： cell death rate of RGCs after 24 h of simultaneous treatment with 300 μmol/L NaHS and OGD； B： cell death rate of RGCs treated by NaHS 12~24 h before OGD； C： cell death rate of RGCs treated with NaHS at different time points （from 0 to 12 h） after OGD.Mean±SEM.n=8.#P<0.05， ##P<0.01 vs vehicle group； *P<0.05， **P<0.01 vs OGD group； △P<0.05 vs NaHS group.圖2 NaHS不同時(shí)間處理對OGD損傷RGC的保護(hù)作用

3 NaHS可激活原代RGCs上KATP通道

電流鉗模式下，NaHS或pinacidil處理后，細(xì)胞膜電位從（-61.7±2.9） mV 顯著超極化到（-69.2±4.1）mV（P<0.05）或（-72.2±5.3） mV（P<0.05）（圖3A），誘發(fā)放電數(shù)量也顯著降低（P<0.01）（圖3B），而這些現(xiàn)象可被glibenclamide阻斷（圖3A、B）。電壓鉗模式下， NaHS 或pinacidil 可在-140 mV~-80 mV 電壓下增加內(nèi)向電流（P<0.05），而在40 mV~60 mV 電壓下外向電流增加不顯著，而給予glibenclamide 可抑制內(nèi)向電流的增加（圖3C、D）。

Figure 3.Effect of NaHS on membrane potential， excitability and current density measurements in RGCs.A： RGCs resting potential in the presence of NaHS and/or glibenclamide/pinacidil （n=26）； B： number of induced action potentials by 300 pA current in the presence of NaHS and/or glibenclamide/pinacidil （n=29）； C： current-voltage relationships obtained by voltage clamp ranging from -140 to +60 mV in the vehicle and in the presence of NaHS and/or glibenclamide （n=19）； D： currentvoltage relationships by voltage clamp ranging from -140 to +60 mV in the vehicle and in the presence of pinacidil and/or glibenclamide （n=19）.Mean±SEM.*P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##<0.01 vs NaHS group； △P<0.05 vs pinacidil group.圖3 外源性NaHS對RGCs細(xì)胞膜電位、誘發(fā)電位和細(xì)胞膜電流的影響

4 NaHS 激活KATP 通道對缺氧導(dǎo)致的離體原代RGCs損傷的保護(hù)作用

如圖4A顯示，OGD 處理RGCs后，鈣離子內(nèi)流顯著增加，而NaHS 后處理或pinacidil 預(yù)處理可顯著降低OGD 導(dǎo)致RGCs鈣內(nèi)流，并且給予glibenclamide 阻斷KATP通道后，鈣離子內(nèi)流又顯著增加，這提示NaHS減少OGD 導(dǎo)致的細(xì)胞鈣內(nèi)流是通過激活KATP通道實(shí)現(xiàn)的；其次，還觀察了NaHS 對OGD 導(dǎo)致RGCs 死亡率的影響。如圖4B所示，外源性硫化氫供體（NaHS）或pinacidil 處理可顯著降低OGD 導(dǎo)致的細(xì)胞死亡率（P<0.01），而給予glibenclamide 阻斷激活的KATP通道，細(xì)胞死亡率又顯著升高，這與圖4A 所示鈣成像的結(jié)果相似。最后，在OGD 處理后cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加，而給予NaHS 或pinacidil 后cleaved caspase-3 表達(dá)也顯著低于OGD 組（P<0.01），而給予glibenclamide 阻斷KATP通道后cleaved caspase-3 表達(dá)量顯著增高（圖4C）。

Figure 4.NaHS reduced cell death in primary RGCs injured by OGD through activation of KATP channel.A： representative images of intracellular Ca2+ stained by Flou-4 AM and corresponding fluorescence ratio of intracellular ［Ca2+］ in RGCs after OGD，treated with NaHS and/or glibenclamide， OGD led to a significant increase in calcium influx in primary RGCs， and NaHS or pinacidil significantly reduced OGD-induced intracellular calcium overload.The scale bar=10 μm.Arrows indicate typically increased calcium influx.B： Hoechst 33258 staining and quantitative analysis of RGCs treated with vehicle， NaHS/pinacidil or/and glibenclamide following OGD.OGD induced obvious nuclear pyknosis in primary RGCs， and the proportion of nuclear pyknosis was significantly less after treatment with NaHS or pinacidil.The scale bar=25 μm.Arrows indicate typical pyknotic nucleus； C：cleaved caspase-3 expression in RGCs treated with vehicle， NaHS/pinacidil or/and glibenclamide after OGD.Mean±SEM.n=7.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs OGD group； △P<0.05， △△P<0.01 vs OGD+NaHS group； ▲P<0.05， ▲▲P<0.01 vs OGD+Pinacidil group.圖4 外源性NaHS激活KATP鉀通道減輕OGD導(dǎo)致的RGCs損傷

5 NaHS激活KATP通道對在體缺血視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用

建立在體視網(wǎng)膜缺氧模型，如圖5A~F 所示，組織學(xué)切片可觀察到視網(wǎng)膜厚度（主要為INL）顯著降低（P<0.05），GCL 細(xì)胞密度顯著減少（P<0.01），在給予玻璃體腔注射NaHS 或pinacidil 預(yù)注射顯示，視網(wǎng)膜厚度（主要為INL）較治療前顯著恢復(fù)（P<0.05），單位長度GCL 細(xì)胞數(shù)量也顯著增多（P<0.05）。而同時(shí)給予glibenclamide 阻斷KATP通道后，INL厚度變薄，且RGCs數(shù)量也減少。

討 論

視網(wǎng)膜缺血缺氧是一種非常嚴(yán)重的病理生理變化過程，一般可由于青光眼導(dǎo)致的眼內(nèi)壓升高引起［18］，也可由視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈栓塞［19］或糖尿病視網(wǎng)膜病變引起［20］。缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致非常復(fù)雜的變化，目前細(xì)胞缺氧模型常見的有厭氧培養(yǎng)和氧糖剝奪兩種常見方法［21］，由于器官缺血血流中斷都會(huì)限制氧氣和葡萄糖向神經(jīng)元的輸送，導(dǎo)致ATP 減少和能量耗盡，從而啟動(dòng)對神經(jīng)元有害的興奮性毒性機(jī)制，因此本實(shí)驗(yàn)在離體實(shí)驗(yàn)選用了氧糖剝奪模型來盡可能模擬缺血的病理生理過程；此外，為進(jìn)一步觀察在體小鼠視網(wǎng)膜缺氧損傷情況，本研究通過無創(chuàng)方法阻斷視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈來模擬在體視網(wǎng)膜缺氧［5］，視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈血流減少可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)層損傷，特別是RGCs層［22］。

視網(wǎng)膜缺血缺氧有急性和慢性，慢性視網(wǎng)膜缺血缺氧可以由慢性青光眼或糖尿病視網(wǎng)膜病變導(dǎo)致，并對視網(wǎng)膜產(chǎn)生慢性損傷［23］，因此在視網(wǎng)膜和RGCs 出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷前需要給予保護(hù)性治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示硫化氫預(yù)處理可以保護(hù)原代RGCs 免受缺氧損傷。另外，急性青光眼或視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈栓塞可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜急性缺血缺氧［24］，因此在缺氧過程中或缺氧后給予神經(jīng)保護(hù)處理也非常重要，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NaHS在缺氧過程中和缺氧后對損傷RGCs均產(chǎn)生保護(hù)作用，同時(shí)在體實(shí)驗(yàn)也觀察到相似的結(jié)果，給予NaHS可以改善缺血缺氧導(dǎo)致的視網(wǎng)膜厚度（特別是INL）變薄和GCL細(xì)胞密度降低。

有研究顯示硫化氫可以提高谷胱甘肽水平，部分減輕過氧化氫誘導(dǎo)的RGC-5 損傷［25］，另外可通過激活Kv 和Kir 通道松弛視網(wǎng)膜血管，減輕視網(wǎng)膜缺血保護(hù)RGCs［26］，同時(shí)也在腦內(nèi)激活KATP通道保護(hù)缺血損傷的神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相似，NaHS 激活KATP通道使細(xì)胞膜超極化，降低細(xì)胞興奮性和鈣離子內(nèi)流，減輕缺血RGCs 死亡率，另外利用通道激動(dòng)劑和阻斷劑結(jié)合用鈣離子成像、細(xì)胞死亡率和細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)顯示，NaHS 對缺氧導(dǎo)致的RGCs 損傷的保護(hù)作用與KATP通道激動(dòng)劑相似，而KATP通道阻斷劑能夠抑制這種保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示硫化氫對原代缺氧RGCs 和在體缺氧視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用可以通過激活KATP通道實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示硫化氫可以通過激活KATP通道減輕原代缺氧RGCs 和在體缺血視網(wǎng)膜的損傷，為視網(wǎng)膜缺血損傷的預(yù)防和治療提供新實(shí)驗(yàn)依據(jù)。