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    基于PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路探討野黃芩苷聯(lián)合虎杖苷抗慢性支氣管炎的作用機(jī)制*

    2023-11-02 10:14:16李敏儀張萌萌衛(wèi)培峰
    中國(guó)病理生理雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:肺泡試劑盒支氣管

    王 祁, 趙 博, 高 璐, 李敏儀, 李 瑤, 張萌萌,衛(wèi)培峰,2, 王 斌, 李 敏△

    (1陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 西安 712046;2陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 712099)

    慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD)是不可逆氣流阻塞和有害環(huán)境刺激的持續(xù)炎癥[1],是全球第三大致病率和致死率的主要因素。COPD 包括一些列疾病,慢性支氣管炎(chronic bronchitis, CB)和肺氣腫是其中典型,大多數(shù)病人同時(shí)患有這兩種疾病的某些特征。流行病學(xué)研究對(duì)CB 沒(méi)有固定定義,但普遍定義為連續(xù)2 年每年有至少3 個(gè)月的慢性咳嗽和痰液產(chǎn)生[2]。CB 臨床表現(xiàn)為肺功能極速下降、易引發(fā)下呼吸道感染。目前,導(dǎo)致CB 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但主要涉及氣道黏液細(xì)胞化生、炎癥反應(yīng)和肺氣腫等[3]。

    CB 的臨床治療是聯(lián)合使用抗生素,而抗生素長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生耐藥性,同時(shí)有較多不良反應(yīng)[4-5]。中醫(yī)藥在CB 和COPD 的治療歷史悠久、優(yōu)勢(shì)獨(dú)特。CB屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽”“喘證”“痰證”“飲證”等范疇,分痰濕蘊(yùn)肺、痰熱郁肺、肝火犯肺和肺陰不足四種證型[6]。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)CB 的認(rèn)識(shí),臨床治療以清熱化痰、宣肺止咳平喘為主。周兆山教授[7]運(yùn)用黃芩-虎杖(Huzhang, HZ)配伍治療COPD 具有顯著療效。課題組前期研究了黃芩莖葉(Huangqin Jingye,HQJY)的抗炎活性,證實(shí)HQJY 在肺系感染性疾病中具有重要作用,同時(shí)配伍HZ 可增強(qiáng)清熱、瀉肺和化痰止咳之力。因此本研究以HQJY和HZ的標(biāo)志性成分野黃芩苷(scutellarin, Scu)和虎杖苷(polydatin,PD)作為研究對(duì)象,探究其抗大鼠CB 的藥效及作用機(jī)制,同時(shí)設(shè)置了桂龍咳喘寧片(Guilong Kechuanning tablet, GLKCN)作為陽(yáng)性對(duì)照,驗(yàn)證Scu聯(lián)合PD的療效,為后續(xù)研究呼吸系統(tǒng)疾病提供用藥參考資料。

    材 料 和 方 法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 藥物 HQJY-HZ 飲片購(gòu)自亳州京晥中藥飲片廠(chǎng);Scu 和PD 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(純度≥98%);GLKCN 購(gòu)自江西藥都仁和制藥有限公司;稱(chēng)取干燥HQJY 和HZ飲片各50 g,混勻后加入1 L水浸泡30 min,武火煮沸后改文火煎煮50 min,過(guò)濾,再加入800 mL蒸餾水同法煎煮40 min,合并兩次濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃濃縮至200 mL,過(guò)濾,制成含生藥量0.5 g/mL的濃縮液。

    1.2 動(dòng)物 90 只SPF 級(jí)SD 雄性健康大鼠,6~8 周齡,體質(zhì)量(200±20) g,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(川)2020-030。動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào):SUCMDL-2022041201。

    1.3 試劑 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)自Sigma;白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、IL-17A、IL-10 和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抗體購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒、RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

    1.4 儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher);小型垂直電泳槽(Bio-Rad);熒光定量PCR 儀(Roche);轉(zhuǎn)膜儀(BioTek)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、HQJY-HZ 水煎液(5 g/kg)組[8]、Scu (40 mg/kg)組[9]、PD (60 mg/kg)組[10]、高 劑 量(80 mg/kg+120 mg/kg) Scu+PD (Scu+PD-H)組、中 劑 量(40 mg/kg+60 mg/kg) Scu+PD(Scu+PD-M)組、低劑量(20 mg/kg+30 mg/kg) Scu+PD (Scu+PD-L)組和GLKCN (1 g/kg)組,每組10 只。于第1 天和第30 天用乙醚麻醉大鼠,采用氣管滴注法[11]構(gòu)建大鼠CB 模型。具體操作如下:插入進(jìn)樣針至氣管入口1 cm 處,緩慢推注1 mL/kg 的LPS 溶液(1.5 mg/kg),輕搖,使LPS 均勻分布在大鼠兩肺;第2~60 天(第30 天除外),將大鼠置于120 cm×60 cm×50 cm 的自制煙熏箱中30 min,每次10 根香煙,每天2 次,每次煙熏間隔6 h,建立CB 模型。從造模第47天起灌胃給藥,藥物組給予相應(yīng)劑量的藥物,對(duì)照和模型組灌胃等體積(10 mL/kg)生理鹽水。

    2.2 動(dòng)物處理 在末次給藥次日,采用10%水合氯醛麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血,靜置30 min,1 509×g離心15 min得到血清,-80 ℃保存?zhèn)溆?。采血后剪開(kāi)頸部和胸腔,暴露氣管和肺組織,進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,合并兩次支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),1 048×g離心10 min 后分離上清液和沉淀物待測(cè)。灌洗完后,取大鼠右肺組織計(jì)算濕/干(wet/dry, W/D)質(zhì)量比值;收集肺組織和支氣管于4%多聚甲醛中固定,用于肺組織和支氣管病理?yè)p傷觀(guān)察和組織評(píng)分;剩余肺組織封裝存于-80 ℃檢測(cè)相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)。

    2.3 大鼠右肺組織W/D 質(zhì)量比值測(cè)定 將右肺組織處理后分別置于分析天平上精確稱(chēng)量濕質(zhì)量和干質(zhì)量,計(jì)算質(zhì)量比,判斷肺組織水腫程度。

    2.4 大鼠BALF中蛋白含量測(cè)定及白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 取BALF 上清液0.5 mL,按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白含量,取BALF沉淀物用生理鹽水稀釋至3 mL,168×g離心10 min 后吸取細(xì)胞懸液固定,干燥后瑞氏染色于顯微鏡下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    2.5 組織病理學(xué)觀(guān)察及評(píng)分 將每組于4%的多聚甲醛固定的樣品脫水后制備石蠟標(biāo)本,切片后HE染色,在光鏡下觀(guān)察支氣管和肺組織損傷程度。在雙盲情況下采用Smith 評(píng)分方法[12],觀(guān)察指標(biāo)包括:(1)肺泡充血程度;(2)出血;(3)肺間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);(4)肺泡胞壁程度[13]。按評(píng)分指標(biāo)對(duì)每張切片進(jìn)行觀(guān)察及評(píng)分。

    2.6 支氣管和血清炎癥因子測(cè)定 參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟,測(cè)定大鼠支氣管和血清中IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和TNF-α炎癥因子含量。

    2.7 SOD 活性和MDA 含量測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肺組織中SOD活性和MDA含量。

    2.8 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表達(dá) 用Trizol 提取大鼠肺組織總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以β-actin為內(nèi)參照,檢測(cè)PI3K、AKT和mTOR的mRNA 表達(dá)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PI3K 的上游引物序列為5'-AAGCAGGCAGCCGAGTATC-3',下游引物序列為5'-TTTCGTTTCCCACCATTC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為89 bp;AKT的上游引物序列為5'-CTACGGTGCGGAGATTGTG-3',下游引物序列為5'-AGAACGTCTTCATGGTGGC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為95 bp;mTOR 的上游引物序列為5'-GAGATACGCCGTCATTCCT-3',下游引物序列為5'-GCTCAAACACCTCCACCTT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為97 bp;β-actin的上游引物序列為5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3',下游引物序列為5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為165 bp。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 10 s,45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完后分析熔解曲線(xiàn),采用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA相對(duì)表達(dá)。

    2.9 Western blot 檢測(cè)PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 和p-mTOR 蛋白水平 用RIPA 裂解緩沖液提取蛋白并按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定濃度,隨后將蛋白上樣、轉(zhuǎn)模、封閉,分別加入Ⅰ抗,于4 ℃下過(guò)夜;第2 天TBST 清洗后再加入Ⅱ抗,孵育、洗膜、顯影、掃描,使用ImageJ軟件計(jì)算條帶灰度值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 22.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,應(yīng)用GraphPad Prism 7 軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用單因素方差分析進(jìn)行組間檢驗(yàn),LSD 法進(jìn)行檢驗(yàn)后多重比較。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 大鼠右肺W/D質(zhì)量比值的變化

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠右肺W/D 質(zhì)量比值顯著升高(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJYHZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠右肺W/D 質(zhì)量比值均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見(jiàn)圖1。

    Figure 1.Wet/dry (W/D) mass ratio of the right lung of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group.圖1 各組大鼠右肺濕/干質(zhì)量比值

    2 大鼠BALF 中蛋白含量、白細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量的變化

    與對(duì)照組相比,模型組大鼠BALF 中蛋白含量、白細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠BALF 中蛋白含量、白細(xì)胞數(shù)量和中性粒細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05 或P<0.01), 見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)Table 1.Protein content, leukocyte count and neutrophil count in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group(Mean±SD.n=10)

    3 大鼠組織病理學(xué)觀(guān)察及評(píng)分

    對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核大小均勻,肺泡腔清晰可見(jiàn),無(wú)炎癥細(xì)胞浸出和肺泡壁增厚等病理學(xué)改變;模型組大鼠肺泡組織破壞,有紅細(xì)胞滲出,細(xì)胞核變形,可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞,肺泡壁明顯增厚,肺泡間質(zhì)有水腫、增生;與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組的炎癥細(xì)胞浸出明顯減少,肺間質(zhì)水腫明顯減輕,見(jiàn)圖2。

    對(duì)照組大鼠支氣管上皮細(xì)胞排列整齊、支氣管管腔清晰、無(wú)杯狀細(xì)胞增生現(xiàn)象,支氣管通暢無(wú)阻塞;模型組大鼠支氣管上皮細(xì)胞排列錯(cuò)亂,出現(xiàn)杯狀細(xì)胞增生現(xiàn)象,支氣管周邊有較多炎癥介質(zhì)浸潤(rùn),管腔有阻塞現(xiàn)象;GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠支氣管管周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和環(huán)節(jié)細(xì)胞增生現(xiàn)象均有不同程度減輕,見(jiàn)圖3。

    Figure 3.Pathological changes of rat bronchi in each group (HE staining, scale bar=20 μm).圖3 各組大鼠支氣管病理變化

    4 大鼠BALF中IL-1β和IL-6含量的變化

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠BALF 中IL-1β 和IL-6 水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠BALF 中IL-1β和IL-6水平均顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖4。

    Figure 4.The levels of IL-1β (A) and IL-6 (B) in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs model group.圖4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-6水平

    5 大鼠血清IL-17A、TNF-α和IL-10水平的變化

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.01),IL-10 水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平均顯著降低(P<0.05 或P<0.01),IL-10 水平顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖5。

    Figure 5.The levels of IL-17A (A), TNF-α (B) and IL-10 (C) in serum of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group.圖5 各組大鼠血清中IL-17A、TNF-α和IL-10水平

    6 大鼠肺組織勻漿中MDA和SOD含量的變化

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織勻漿中MDA含量顯著增多(P<0.01),SOD 活性顯著降低(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織勻漿中MDA 含量均顯著減少(P<0.01),SOD活性顯著升高(P<0.01),見(jiàn)圖6。

    Figure 6.The MDA content (A) and SOD activity(B) in lung tissue homogenate of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs model group.圖6 各組大鼠肺組織勻漿中MDA含量和SOD活性

    7 大鼠肺組織中PI3K/AKT/mTOR 的mRNA表達(dá)

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織中PI3K、AKT和mTOR 的mRNA 表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖7。

    Figure 7.The mRNA expression of PI3K (A), AKT (B) and mTOR (C) in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs model group.圖7 各組大鼠肺組織中PI3K、AKT和mTOR的mRNA表達(dá)

    8 大鼠肺組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠大鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 蛋白水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 組大鼠肺組織中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白水平均顯著降低(P<0.01),其中Scu+PD-H組抑制PI3K、AKT 和mTOR 蛋白磷酸化的作用最為顯著(P<0.01),見(jiàn)圖8。

    Figure 8.The protein levels of PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT, mTOR and p-mTOR in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs model group.圖8 各組大鼠肺組織中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

    討 論

    CB 是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,是導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一[14]。CB 的特征是氣管和支氣管黏膜慢性炎癥和痙攣,導(dǎo)致呼吸困難、咳嗽、痰液產(chǎn)生等癥狀[15]。CB 屬中醫(yī)咳嗽、喘證范疇[16]。在LPS 誘導(dǎo)的CB 模型中,HQJY 配伍HZ 可治肺熱咳嗽、氣喘痰多。經(jīng)查閱相關(guān)資料,本研究采用HQJY 和HZ 中含量最高的有效成分Scu 和PD 進(jìn)行后續(xù)大鼠實(shí)驗(yàn)。

    多種病理生理過(guò)程都有炎癥的存在,炎癥有助于機(jī)體抵御外來(lái)微生物的侵襲,但過(guò)度炎癥應(yīng)激反應(yīng)會(huì)加重機(jī)體的負(fù)擔(dān)。本研究通過(guò)免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)估炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度[17],結(jié)果提示CB 模型大鼠BALF 中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞升高,炎癥反應(yīng)被激活,經(jīng)藥物干預(yù)后支氣管損傷減輕,炎癥水平降低,提示Scu 和PD 有抗炎效果,與既往研究相符。有研究表明Scu 和PD 可通過(guò)抑制IL-1β、IL-6、IL-17A 及TNF-α 的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)IL-10 的表達(dá),來(lái)減輕呼吸道炎癥而發(fā)揮肺保護(hù)作用[18-19]。因此,針對(duì)這些炎癥因子的調(diào)控是CB治療的一個(gè)潛在方向。

    CB 常常會(huì)引起氧化應(yīng)激,即機(jī)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過(guò)多,而抗氧化能力相對(duì)下降[20]。本研究顯示在大鼠肺組織內(nèi)SOD活性和MDA含量在LPS滴注加煙熏后均顯著增加,而肺病理?yè)p傷狀態(tài)與氧自由基含量有關(guān),在肺組織中SOD變化和MDA變化趨勢(shì)相悖,說(shuō)明該疾病形成過(guò)程中不斷在消耗SOD 產(chǎn)生大量氧自由基,引起肺組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致肺組織大面積損傷;給藥后氧化應(yīng)激損傷均不同程度減輕。

    PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路是一條重要的炎癥通路,在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[21]。PI3K作為細(xì)胞膜上的酶通過(guò)磷酸化作用將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇三磷酸,從而激活下游的AKT 和mTOR 等信號(hào)分子[22]。炎癥因子通過(guò)細(xì)胞膜上的受體激活PI3K,繼而與AKT 的N 端PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合促進(jìn)AKT 的磷酸化,促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、代謝等生理過(guò)程[23]。mTOR 是AKT 的下游信號(hào)分子,可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程[24]。研究表明,炎癥細(xì)胞可以通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控多種炎癥因子,促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和凋亡抑制,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加?。?5-26]。此外,當(dāng)組織受到氧化應(yīng)激、損傷等刺激時(shí),也會(huì)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷,加劇CB 的發(fā)展[27]。本研究結(jié)果顯示,各種藥物均通過(guò)降低CB 大鼠肺組織中PI3K/AKT/mTOR 通路的活化,進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),阻斷CB進(jìn)一步發(fā)展。

    綜上所述,Scu 聯(lián)合PD 可抑制CB 大鼠的炎癥反應(yīng),其抗炎作用與抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路活化,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制炎癥因子IL-17A、TNFα、IL-1β和IL-6有關(guān)。然而,單獨(dú)提高Scu或PD的劑量,且在無(wú)毒副作用的范圍內(nèi),是否可以達(dá)到Scu 和PD聯(lián)用的效果,尚待研究。

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