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    三七總皂苷對(duì)低氧狀態(tài)下大鼠PASMCs增殖、凋亡及Notch3通路的影響*

    2023-11-02 10:14:14白相書田云娜徐俊鵬袁琳波王萬(wàn)鐵
    中國(guó)病理生理雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:低氧孵育通路

    白相書, 黃 曼, 田云娜, 徐俊鵬, 袁琳波, 張 賽△, 王萬(wàn)鐵△

    (1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽(yáng)醫(yī)院/平陽(yáng)縣人民醫(yī)院公共衛(wèi)生科,浙江 平陽(yáng) 325400;2溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系,浙江 溫州 325035)

    低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertention, HPH)是高原常見的低氧誘導(dǎo)疾病,通常會(huì)導(dǎo)致平均肺動(dòng)脈壓和右心肥厚指數(shù)升高[1]。臨床數(shù)據(jù)表明HPH 是一種預(yù)后差,病死率高的疾?。?],HPH 的病理生理基礎(chǔ)包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增生、肺血 管收 縮 和 原 位血 栓形 成[3]。HPH 的形成及發(fā)展主要與低氧性肺血管收縮及肺血管重建有關(guān)[4],血管平滑肌細(xì)胞的增殖對(duì)于HPH 肺血管重構(gòu)(pulmonary vascular remodeling, PVR)來(lái)說至關(guān)重要。到目前為止對(duì)于PASMCs 增殖的分子機(jī)制研究尚不清晰明確,因此對(duì)于其具體分子機(jī)制的探討就顯得尤為重要。

    有研究表明,血管平滑肌細(xì)胞衍生的Notch3 信號(hào)通路是主動(dòng)脈高肌化和血管開放喪失的關(guān)鍵中介[5],Notch 是調(diào)節(jié)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的基本信號(hào)機(jī)制之一[6],Notch 信號(hào)與血管形態(tài)和功能密切相關(guān),Notch 信號(hào)通路調(diào)控肺動(dòng)脈血管重構(gòu),參與血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化和凋亡,對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用[7-8]。肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Notch3的過度表達(dá)是人類肺動(dòng)脈高壓的主要特點(diǎn)[9],因此,本研究探究三七總皂苷(Panax notoginsengsaponins, PNS)是否通過Notch3 信號(hào)通路改善HPH 以及其機(jī)制,以期為臨床防治HPH 提供新的治療思路和方法。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞與試劑

    大鼠PASMCs 購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠Notch3、Hes-1、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和caspase-3 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)于Biosharp;CCK-8 試劑盒購(gòu)于Dojindo;BeyoClick? EdU-488 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天公司;TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于翌圣生物科技(上海)股份有限公司;Notch3 通路γ-分泌酶抑制劑DAPT{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butyl ester}濃 度 為20 mmol/L,DMEM稀釋到使用濃度10 μmol/L。

    2 主要方法

    2.1 細(xì)胞模型制備及分組 取3~9 代的原代PASMCs 細(xì)胞饑餓處理24 h,隨機(jī)分為6 組:正常對(duì)照(control, Con)組、低氧(hypoxia, Hypo)組、Hypo+PNS 組、Hypo+DAPT 組、Hypo+過表達(dá)Notch3(Hypo+Notch3)組和Hypo+Notch3+PNS 組。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)分組加入不同的培養(yǎng)混合液。Con 組置于常氧(21%O2、5% CO2、74% N2)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h;Hypo組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng),Hypo+PNS 組用完全培養(yǎng)基配制100 mg/L PNS 培養(yǎng),Hypo+DAPT 組用完全培養(yǎng)基配制10μmol/L DAPT 培養(yǎng),Hypo+Notch3 組過表達(dá)Notch3 按照Lip2000的試劑盒處理24 h后,換用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),Hypo+Notch3+PNS 組過表達(dá)Notch3 按照質(zhì)粒說明書處理24 h 后,換用完全培養(yǎng)基配制的100 mg/L PNS 培養(yǎng),后5 組均置于低氧(5% O2、6% CO2、89% N2)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

    2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的活性 配制CCK-8 工作液。將準(zhǔn)備進(jìn)行操作的96 孔板從培養(yǎng)箱中取出,用200 μL 移液槍將舊培養(yǎng)基吸出,用PBS 洗1 遍。棄去PBS后,每孔加入110 μL配制好的CCK-8工作液;放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h;最后用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光度(A)值。

    2.3 EdU 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于24 孔板,造模處理后,每孔加入EdU 工作液500 μL,原培養(yǎng)液保留,繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h;去除培養(yǎng)液加1 mL 固定液(4%多聚甲醛),洗3 次,每次5 min;每孔加1 mL通透液,室溫15 min,PBS洗3次,每次5 min;每孔加0.5 mL click 反應(yīng)液,避光孵育30 min,洗3 次,每 次5 min;每 孔1 mL 1× Hoechest 33342,避光孵育10 min,洗3 次,每次5 min。封片后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

    2.4 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將自然晾干的細(xì)胞爬片浸入固定液,室溫固定20 min;PBS 漂洗3 次,每次5 min;將樣本浸入通透液中,37 ℃ 、10 min;PBS漂洗3次,每次5 min;后續(xù)操作按照試劑盒進(jìn)行。最后使用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照觀察,計(jì)算TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

    2.5 RT-qPCR 檢測(cè)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3的mRNA 表達(dá)水平 造模結(jié)束的細(xì)胞去除培養(yǎng)液并洗滌后,10 cm培養(yǎng)皿中加入1 mL Trizol,加入Trizol 后需上下顛倒混勻10 次左右,冰上放置10~15 min;加氯仿200 μL(大約占總體積的1/5),用槍頭吹打充分混勻后,上下顛倒混勻10 次并劇烈搖晃,置冰上反應(yīng)10~15 min;4 ℃、12 000 r/min 離心25 min,轉(zhuǎn)上層水相于另一個(gè)1.5 mL EP管中,異丙醇體積與上層水相體積相同,上下顛倒混勻10~15 次后,冰上放置15 min 至20 min,再次離心收集RNA。測(cè)完RNA 濃度后,進(jìn)行cDNA 合成、gDNA 去除及qPCR體系與條件的操作,以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

    表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

    2.6 Western blot 檢測(cè)Notch3、Hes-1、PCNA 和caspase-3 的蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞造模結(jié)束后,從37 ℃培養(yǎng)箱中取出置于冰上,用預(yù)冷過的PBS 按照每孔1~2 mL 加入每孔中洗滌3 次,隨后加入適量細(xì)胞裂解混合液到每孔進(jìn)行裂解30 min,離心后收集上清。將每組的蛋白濃度統(tǒng)一稀釋成定量濃度(5 mg/L),再置于滾沸的開水中煮8~10 min 備用。每組加20μg蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜完成后,用鑷子將膜緩慢取出放入到10%脫脂奶粉溶液中浸沒,隨后將盒子放到搖床上孵育至少2 h。加入Ⅰ抗(Notch3、Hes-1、PCNA 和caspase-3 抗體均為1∶1 000 稀釋,內(nèi)參照β-actin 為1∶5 000 稀釋)放置于4 ℃搖床上過夜。次日將孵育的Ⅰ抗用移液槍進(jìn)行回收,迅速的沿盒子邊緣加入TBST,漂洗4 次,每次5 min,洗滌后孵育Ⅱ抗。Ⅱ抗孵育結(jié)束后,用TBST洗膜4次,每次5 min。于曝光儀中將化學(xué)發(fā)光液均勻滴加到PVDF膜上,曝光并保存結(jié)果。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同濃度PNS對(duì)PASMCs活力的影響

    CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,400、800、1 600 mg/L PNS可顯著降低正常培養(yǎng)的PASMCs 活力(P<0.01),僅在200 mg/L 的濃度以下,PNS 對(duì)細(xì)胞活性不產(chǎn)生明顯影響(P>0.05),見圖1。而在低氧培養(yǎng)條件下,低氧組PASMCs 細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)(P<0.05),PNS 濃度在100、200 mg/L 時(shí)可顯著下調(diào)低氧處理的PASMCs 細(xì)胞活性(P<0.01)。因此后續(xù)選擇100 mg/L的PNS濃度用于抑制細(xì)胞活力,見圖2。

    Figure 1.Effects of different concentrations of Panax notoginseng saponins (PNS) on the viability of rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) under normoxia condition.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs 0 mg/L group.圖1 不同濃度PNS 對(duì)正常氧條件下大鼠PASMCs 活力的影響

    Figure 2.Effects of different concentrations of Panax notoginseng saponins (PNS) on the viability of rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) induced by hypoxia (Hypo).Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control(Con) group; ##P<0.01 vs Hpyo group.圖2 不同濃度PNS對(duì)低氧條件下大鼠PASMCs活力的影響

    2 PNS對(duì)PASMCs增殖的影響

    EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞為綠色,藍(lán)色代表細(xì)胞核。低氧組相對(duì)于對(duì)照組而言出現(xiàn)明顯細(xì)胞增殖(P<0.01);給予PNS干預(yù)后,PASMCs增殖能力明顯低于低氧組(P<0.01);給予Notch3 抑制劑DAPT 干預(yù)后,增殖能力較低氧組明顯減弱(P<0.01),見圖3。

    Figure 3.The proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) on each group detected by EdU staining (×200).Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control (Con) group; ##P<0.01 vs hypoxia (Hypo) group.圖3 EdU染色檢測(cè)大鼠PASMCs的增殖能力

    3 TUNEL檢測(cè)PASMCs細(xì)胞凋亡情況

    TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色,藍(lán)色代表細(xì)胞核。相對(duì)于對(duì)照組,低氧組細(xì)胞凋亡水平顯著下降(P<0.01);給予PNS 干預(yù)后,凋亡水平顯著高于低氧組(P<0.01),見圖4。

    Figure 4.The apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) determined by TUNEL staining (×200).Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control (Con) group; ##P<0.01 vs hypoxia (Hypo) group.圖4 PNS可促進(jìn)低氧條件下大鼠PASMCs的凋亡水平

    4 PNS 及Notch3 抑 制 劑 處 理 對(duì)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

    RT-qPCR 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氧組Notch3、Hes-1 和PCNA mRNA 表 達(dá) 水 平 增 高(P<0.01),caspase-3 mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.01);給予PNS 或Notch 3 抑制劑干預(yù)后,Notch3、Hes-1 和PCNA mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.01),caspase-3 mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05),見圖5。

    Figure 5.Relative mRNA expression levels of Notch3, Hes-1, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs).Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control (Con) group; #P<0.05, ##P<0.01 vs hypoxia (Hypo) group.圖5 各組大鼠PASMCs中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3的mRNA表達(dá)水平

    5 PNS 及Notch3 抑 制 劑 處 理 對(duì)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

    Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氧組Notch3、Hes-1 以及PCNA 蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05),caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);給予PNS 或Notch3 抑制劑干預(yù)后,Notch3、Hes-1 以及PCNA 蛋白表達(dá)水平低于低氧組P<0.05),caspase-3 蛋白表達(dá)水平高于低氧組(P<0.01),見圖6。

    Figure 6.The protein expression of Notch3, Hes-1, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control (Con) group; #P<0.05, ##P<0.01 vs hypoxia (Hypo) group.圖6 Western blot檢測(cè)各組大鼠PASMCs中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3蛋白的表達(dá)

    6 PNS 及 過 表 達(dá)Notch3 處 理 后 對(duì)PASMCs 中Notch3和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的影響

    6.1 Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平 RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氧組Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);給予PNS 干預(yù)后,Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于低氧組(P<0.05);與低氧+PNS 組相比,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Notch3 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)PNS 對(duì)Notch3 mRNA 和蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05);與低氧+Notch3 組相比,在此基礎(chǔ)上給予PNS仍可降低Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平(P<0.05),見圖7。

    Figure 7.The mRNA and protein expression of Notch3 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs).A: relative mRNA expression of Notch3 and PCNA of in rat PASMCs detected by RT-qPCR; B:relative protein expression of Notch3 and PCNA in rat PASMCs detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control(Con) group; #P<0.05, ##P<0.01 vs hypoxia(Hypo) group; &P<0.05, &&P<0.01 vs Hypo+Panax notoginseng saponins (PNS) group; △P<0.05, △△P<0.01 vs Hypo+Notch3 group.圖7 各組大鼠PASMCs中Notch3和PCNA的mRNA和蛋白表達(dá)

    6.2 PCNA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平 RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,低氧組PCNA的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);給予PNS 干預(yù)后,PCNA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于低氧組(P<0.05);與低氧+PNS 組相比,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Notch3 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)PNS 對(duì)PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05),見圖7。

    討 論

    HPH 是一種以血管阻力持續(xù)性升高和血管重塑為特征的進(jìn)展性疾病[10],多發(fā)于慢性阻塞性肺疾病、睡眠呼吸障礙和間質(zhì)性肺疾病患者,主要是由于長(zhǎng)期缺氧造成了肺內(nèi)皮細(xì)胞受損,內(nèi)皮舒張因子減少,引起肺血管收縮和重塑,進(jìn)而導(dǎo)致了HPH 的發(fā)生[11]。HPH 的發(fā)病機(jī)制與Notch 信號(hào)通路有關(guān)[12],Notch 信號(hào)在血管平滑肌細(xì)胞的分化、生理和功能中同樣發(fā)揮著重要作用,而其中的Notch3 主要通過調(diào)節(jié)PASMCs的增殖進(jìn)而影響PVR,所以我們將Notch3信號(hào)通路作為本次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)信號(hào)通路。

    Hes-1 是 Notch 通路下游靶基因 HES 蛋白家族成員, Notch3 受體蛋白可調(diào)控 Hes-1蛋白的表達(dá)[13],通過Hes-1 表達(dá)的檢測(cè),可以進(jìn)一步了解Notch3 信號(hào)通路情況。PCNA 與細(xì)胞DNA 合成關(guān)系密切,在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用,是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo),而caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[14],對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)可進(jìn)一步探究PASMCs的增殖及凋亡情況。

    三七是五加科人參屬植物三七的干燥根及根莖,具有化瘀止血和消腫止痛等功效,在傳統(tǒng)中藥中作為一種活血化瘀類藥品被廣泛應(yīng)用[15],其化學(xué)成分主要包括有人參皂苷、三七皂苷、三七素及多糖,其中PNS 是主要有效成分[16]。根據(jù)Xu 等[17]研究發(fā)現(xiàn),三七的活性物質(zhì)三七皂苷R1 能通過降低ERK、p38的表達(dá),減輕缺氧和高碳酸血癥引起的離體大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的血管收縮,從而降低PAH。因此本次實(shí)驗(yàn)從Notch3 信號(hào)通路進(jìn)行研究,探討PNS 是否同樣可以通過該信號(hào)通路發(fā)揮防治PAH的作用。

    目前的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18-20],低氧可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證明[21],PNS 可以抑制低氧高二氧化碳引起的PASMCs 細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明:低氧可誘導(dǎo)PASMCs 增殖、抑制PASMCs凋亡;PNS可通過抑制Notch3表達(dá)顯著下調(diào)低氧誘導(dǎo)的PCNA 的表達(dá),抑制PASMCs 增殖、促進(jìn)PASMCs凋亡。

    綜上所述,在低氧條件下,PNS 可通過抑制Notch3 信號(hào)通路減輕PASMCs 的增殖、促進(jìn)PASMCs的凋亡,從而緩解HPH。

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