光質(zhì)對(duì)等鞭金藻的生長(zhǎng)和生物活性產(chǎn)物合成的影響

鐘彩榮,陳欽常,許涵玥,曾子航,徐紹絲,車(chē)丹丹,2,方靜平*,何勇錦,2*

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心,福州 350117

海洋微藻是一種多功能型的細(xì)胞工廠,可合成色素、多糖、多不飽和脂肪酸PUFAs等多種活性產(chǎn)物,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品等領(lǐng)域[1]。在眾多的海洋微藻藻種中,等鞭金藻(Isochrysis)具有生長(zhǎng)快、光合效率高、巖藻黃素與多不飽和脂肪酸(PUFAs,如十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸)合成能力強(qiáng)、無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn),受到科技工作者和微藻企業(yè)家的關(guān)注,已應(yīng)用于開(kāi)發(fā)意大利面、餅干、酸奶等功能性食品[2]。有研究報(bào)道,巖藻黃素被證實(shí)具有抗炎、抗肥胖、抗癌、抗菌、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、改善代謝、治療呼吸道疾病等多種藥理作用[3];多不飽和脂肪酸也能改善糖尿病、骨質(zhì)疏松癥[4];胞外多糖能促進(jìn)新陳代謝,增強(qiáng)機(jī)體免疫力。因此,利用等鞭金藻開(kāi)發(fā)巖藻黃素和多不飽和脂肪酸應(yīng)用于食品具有重要的意義。

光質(zhì)是影響光合自養(yǎng)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的重要因素之一[5]。不同的光質(zhì)擁有不同的光量子通量密度、光譜波長(zhǎng)等特性,影響光合自養(yǎng)微藻細(xì)胞的光合作用效率和固碳性能,表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)性能和產(chǎn)物合成的差異[6]。對(duì)于等鞭金藻藻種,已有研究表明不同來(lái)源的等鞭金藻藻種對(duì)光質(zhì)的選擇存在較大差異性[7,8]。例如,Che等[9]研究發(fā)現(xiàn),等鞭金藻先用(來(lái)源韓國(guó)海洋微藻培養(yǎng)中心)混合光(藍(lán)光和紅光)培養(yǎng)再綠光培養(yǎng)可獲得最高的油脂含量(62.5%)。Bu等[10]研究表明,湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)在紅光條件下表現(xiàn)最高的生長(zhǎng)速率;但是,綠光培養(yǎng)的微藻細(xì)胞具有最高的葉綠素含量。值得注意的是,關(guān)于光質(zhì)影響等鞭金藻合成生物活性產(chǎn)物的研究中,科技工作者僅僅關(guān)注光質(zhì)對(duì)等鞭金藻細(xì)胞某一種活性產(chǎn)物合成的影響。然而,正如上文所述,等鞭金藻會(huì)合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸活性物質(zhì)?；诖?需要通過(guò)研究工作篩選出一種合適的光質(zhì),實(shí)現(xiàn)等鞭金藻協(xié)同合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸的平衡,使藻細(xì)胞最大化合成其活性物質(zhì)。

本課題組前期研究表明,在中試規(guī)模柱式光反應(yīng)器(50 L)下,采用半連續(xù)培養(yǎng)方式(培養(yǎng)過(guò)程補(bǔ)充氮源和磷酸)養(yǎng)殖等鞭金藻(Isochrysissp.ISO-FJ)可獲得可持續(xù)再生的油脂和巖藻黃素[11]。因此,本研究選擇等鞭金藻(Isochrysissp.ISO-FJ)為出發(fā)藻株,研究三種光質(zhì)(白光、紅光和綠光)對(duì)等鞭金藻協(xié)同合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸性能的影響,為中試調(diào)控等鞭金藻生長(zhǎng)和活性產(chǎn)物合成提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITYUPLC超高液相色譜儀(新加坡沃特斯公司);SCION-436氣相色譜儀(天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司,型號(hào):SCION-GC436,Burker);UV-9600分光光度計(jì)(科遠(yuǎn)貿(mào)易有限公司);BS224S電子秤(北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司);H1650-W湘儀離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

二水合乙二胺四乙酸二鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度≥99.0%,批號(hào):20230424);三氯甲烷(昆山金城試劑有限公司,純度≥99.0%,批號(hào):20201021);硝酸鈉、濃硫酸、維生素H、維生素B12、維生素B1己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度≥99.5%);二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、苯酚、甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司,純度≥99.0%);乙腈、色譜級(jí)甲醇(上海麥克林生化科技有限公司,純度≥99.9%)。

1.2 藻種和培養(yǎng)基

等鞭金藻藻種(Isochrysissp.ISO-FJ)保存于本實(shí)驗(yàn)室,由福清市新大澤螺旋藻有限公司董事長(zhǎng)鄭行捐贈(zèng)。

培養(yǎng)等鞭金藻的培養(yǎng)基為改良后的f/2培養(yǎng)基,組成成分:300 mg/L硝酸鈉,22 mg/L磷酸二氫鈉合水,2.50 × 103mg/L海鹽,12.60 mg/L氯化亞鐵,17.44 mg/L二水合乙二胺四乙酸二鈉,6.92 × 10-3mg/L五水硫酸銅,2.52 × 10-3mg/L鉬酸鈉,8.80 × 10-3mg/L七水硫酸鋅,4.00 × 10-3mg/L六水合氯化鈷,0.07 mg/L四水氯化錳,0.80 mg/L維生素B1,4.00 × 10-3mg/L維生素H,4.00 × 10-3mg/L維生素B12。

1.3 等鞭金藻的培養(yǎng)

將等鞭金藻細(xì)胞接入改良后的f/2培養(yǎng)基中,使用LED白光(400～700 nm)、紅光(620～650 nm)和綠光(500～580 nm)對(duì)其進(jìn)行持續(xù)光照培養(yǎng),藻細(xì)胞初始為3.00 × 106個(gè)/mL,通入1 L/min的空氣。光照強(qiáng)度為45 μmol/(m2·s),培養(yǎng)溫度為23±1 ℃,培養(yǎng)周期為15 d。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 生物量的測(cè)定

每隔3 d取10 mL的藻液,用分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)量藻液的OD值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)數(shù)出等鞭金藻的細(xì)胞數(shù)。等鞭金藻的細(xì)胞個(gè)數(shù)與其OD值的關(guān)系:Y=163.52×104X-3.06(R2=0.999),其中Y(個(gè)/mL)為等鞭金藻細(xì)胞數(shù),X為在680 nm處的OD值。

1.4.2 硝酸氮濃度的測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定硝酸氮的濃度。以硝酸鉀制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算溶液中硝酸氮濃度。硝酸氮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:N=3.14(A220-2A275)+0.01(R2=0.999),其中A220為220 nm處的OD值,A275為275 nm處的OD值,N(mg/L)為硝酸氮濃度。

1.4.3 巖藻黃素的測(cè)定

取150 mL的藻液離心并凍干48 h,向凍干的藻粉中加入5 mL的甲醇,搖勻,避光提取1 h,取上清液過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜,采用UPLC檢測(cè)巖藻黃素。流動(dòng)相流速:0.25 mL/min。色譜柱溫度:40 ℃。樣品室溫度:25 ℃。進(jìn)樣量:2 μL。進(jìn)樣時(shí)間:12 min。配置好濃度梯度為0、20、40、60、80、100 mg/L的巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算巖藻黃素的含量。巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線:F=56 942z+160 887(R2=0.999),其中,F表示峰面積,其中z(mg/L)表示巖藻黃素的含量。

1.4.4 蛋白質(zhì)、糖類、油脂和脂肪酸組成的測(cè)定

采用BCA法[12]測(cè)定等鞭金藻的蛋白質(zhì)含量,硫酸-苯酚法[13]測(cè)定等鞭金藻的多糖含量,采用氯仿-甲醇法[14]測(cè)定等鞭金藻油脂含量。

通過(guò)氣相色譜儀測(cè)定脂肪酸含量[14];載氣為高純度氦氣,檢測(cè)器溫度為260 ℃,注射口溫度為250 ℃,分流比為1∶40,進(jìn)樣量為1 μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。使用Excel和GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)和作圖,采用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)和硝酸氮消耗的影響

等鞭金藻細(xì)胞分別在白、紅和綠光下的生長(zhǎng)情況如圖1A。由圖1A可知,培養(yǎng)結(jié)束后,紅光組的等鞭金藻細(xì)胞數(shù)最低(8.42 × 106個(gè)/mL),白光組的藻細(xì)胞數(shù)最高(1.41 × 107個(gè)/mL)(見(jiàn)圖1A)。Mao等[15]研究發(fā)現(xiàn),等鞭金藻的最大光譜吸收峰為450～500 nm,同時(shí)在550～650 nm有一個(gè)較小的吸收峰。在本研究中,三種光質(zhì)中只有白光的光譜范圍包含了450～500 nm的光譜。因此,由圖1A的結(jié)果可得,在三種光質(zhì)中,白光是最有利于等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)的光質(zhì)。

圖1 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)(A)和硝酸氮消耗(B)的影響

有研究表明,不同光質(zhì)條件下,藻細(xì)胞會(huì)影響硝酸氮的吸收,進(jìn)而呈現(xiàn)明顯差異的細(xì)胞生長(zhǎng)特性[8]。圖1B呈現(xiàn)不同光質(zhì)影響等鞭金藻細(xì)胞吸收硝酸氮的結(jié)果。由圖1B可得,在等鞭金藻培養(yǎng)過(guò)程中,三種光質(zhì)中的硝酸氮濃度都呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)(見(jiàn)圖1B)。與其他組相比,白光組的藻細(xì)胞更有利于硝酸氮的吸收,導(dǎo)致殘留硝酸氮最低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究相似。例如,Gan[16]發(fā)現(xiàn)白光組的小球藻比紅光組更有利于氮元素的吸收。

2.2 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻蛋白質(zhì)、胞內(nèi)多糖和油脂合成的影響

在白、紅和綠光下的等鞭金藻蛋白質(zhì)含量如圖2A所示。在培養(yǎng)過(guò)程中,三種光質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。培養(yǎng)結(jié)束后,紅光和綠光組的等鞭金藻蛋白質(zhì)含量明顯高于白光組的結(jié)果。這結(jié)果表明紅光和綠光更有利于等鞭金藻蛋白質(zhì)的積累。此結(jié)果與Gong等[17]發(fā)現(xiàn)紅光與綠光比白光更有利于石莼蛋白質(zhì)積累的結(jié)果相吻合。但與Huang[18]發(fā)現(xiàn)白光更有利于紫球藻中蛋白質(zhì)的積累存在差異。光質(zhì)對(duì)于微藻的影響存在物種特異性,每種微藻在不同的照明條件下都會(huì)有適合其生長(zhǎng)的最佳光質(zhì),推測(cè)出現(xiàn)兩種完全相反的結(jié)果是因?yàn)樵宸N和培養(yǎng)條件不同造成的。

圖2 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻蛋白質(zhì)(A)、胞內(nèi)多糖(B)和油脂(C)合成的影響

如圖2B所示,在培養(yǎng)過(guò)程中,白、紅、綠光組的等鞭金藻胞內(nèi)多糖含量先增加后降低。培養(yǎng)結(jié)束時(shí),紅光組的等鞭金藻胞內(nèi)多糖含量高(5.81 pg/cell),其次為綠光(5.16 pg/cell),白光組最低(4.98 pg/cell)。已有的研究表明[19],與綠光和白光相比,微藻細(xì)胞在紅光條件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的糖類合成。這可能是紅光比綠光和白光更能提高光能捕獲效率,可促進(jìn)微藻光合利用固碳,進(jìn)而積累糖類化合物。

白光、紅光和綠光下等鞭金藻細(xì)胞的油脂含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化如圖2C所示,三種光質(zhì)下等鞭金藻油脂含量呈遞增趨勢(shì)。微藻油脂合成途徑中關(guān)鍵酶的活性與培養(yǎng)體系中的氮濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),三種光質(zhì)下的硝酸氮濃度逐漸下降(見(jiàn)圖1B),有利于增強(qiáng)等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)油脂代謝中關(guān)鍵酶(如溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶LAT、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGAT)的活力,進(jìn)而提高細(xì)胞內(nèi)油脂含量。培養(yǎng)結(jié)束時(shí),綠光組的等鞭金藻油脂含量最高(20 pg/cell),其次為紅光組(16.51 pg/cell),白光組油脂含量最低(16.26 pg/cell)。Helamieh等[20]證實(shí)了綠光比紅光更有利于柵藻中油脂的積累。前人研究表明[21],在缺氮的情況下,微藻將蛋白質(zhì)和糖分解并優(yōu)先合成油脂,但在本研究中蛋白質(zhì)和胞內(nèi)多糖降低,是不是因?yàn)楸唤到夂铣捎椭枰M(jìn)一步深入研究。

2.3 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻巖藻黃素、胞外多糖、SDA、DHA、PUFAs合成的影響

如圖3所示,巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品和從等鞭金藻中提取的巖藻黃素樣品出峰時(shí)間皆為3.219 min,可初步證明從等鞭金藻中提取的物質(zhì)為巖藻黃素。如圖4所示,三種光質(zhì)中,等鞭金藻巖藻黃素含量先上升后下降,在第6 d時(shí)達(dá)到最大值,此時(shí)綠光組巖藻黃素含量最高(0.78 pg/cell),白光組次之(0.69 pg/cell),紅光組最低(0.66 pg/cell)。Fujita等[22]的研究也表明,綠光能促進(jìn)三角褐指藻中巖藻黃素合成。巖藻黃素主要與葉綠素a結(jié)合形成巖藻黃素-葉綠素蛋白復(fù)合體(FCP),FCP可以捕獲綠色區(qū)域的光能[23],為巖藻黃素的合成提供充足能量。此外,相對(duì)于綠光,紅光和白光釋放更多的光子,形成更高的PPFD/W比值[24],(PPFD:光合光子通量密度;PPFD/W:表示消耗一瓦電所產(chǎn)生的PPFD)促進(jìn)等鞭金藻光合作用,產(chǎn)生更多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起巖藻黃素的氧化(見(jiàn)圖5),使其巖藻黃素的含量降低。由圖4A的結(jié)果可知,綠光比紅光和白光更有利于等鞭金藻巖藻黃素的積累。

圖3 巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和等鞭金藻提取的巖藻黃素樣品(B)色譜圖

圖4 不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻巖藻黃素(A)、胞外多糖(B)、十八碳四烯酸(C)、二十二碳六烯酸(D)和多不飽和脂肪酸(E)的影響

圖5 等鞭金藻生物活性物質(zhì)合成途徑

等鞭金藻胞外多糖在白、紅和綠光中的合成情況如圖4B所示。由圖可知,等鞭金藻在三種光質(zhì)條件下所合成的胞外多糖呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,綠光最有利于等鞭金藻胞外多糖的積累,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)其含量為88.84 mg/L;紅光次之,為75.71 mg/L;白光最次,為66.20 mg/L。這些結(jié)果表明,綠光比紅光和白光更有利于等鞭金藻胞外多糖的積累。

如圖4C～4E所示,等鞭金藻十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸和多不飽和脂肪酸在白光、紅光和綠光條件下都呈遞增趨勢(shì),其中綠光最有利于多不飽和脂肪酸的合成。培養(yǎng)結(jié)束時(shí),綠光下的藻細(xì)胞的十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸和多不飽和脂肪酸最大含量分別為0.74、0.21和1.32 pg/cell。已有的研究表明,微藻細(xì)胞的油脂代謝中關(guān)鍵酶(如脂肪酸合成酶、脫氫酶等)的表達(dá)和活性與其所培養(yǎng)的光質(zhì)存在相關(guān)性。本研究中,等鞭金藻在綠光條件下可能有利于油脂代謝中這些關(guān)鍵酶的活性,促進(jìn)胞內(nèi)油脂及其長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的合成(見(jiàn)圖5)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了白光(400～700 nm)、紅光(620～650 nm)和綠光(500～580 nm)三種不同光質(zhì)對(duì)等鞭金藻的生長(zhǎng)和生物活性產(chǎn)物積累的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同光質(zhì)會(huì)明顯影響等鞭金藻的生長(zhǎng)和生物活性產(chǎn)物的協(xié)同合成。在微藻細(xì)胞生長(zhǎng)方面,與紅光和綠光組相比,采用白光培養(yǎng)等鞭金藻更有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和硝酸氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在生物活性物質(zhì)合成方面,在所選擇三種光質(zhì)中,藻細(xì)胞在綠光條件下可合成最大的巖藻黃素、胞外多糖和PUFAs。由此可見(jiàn),白光可以促進(jìn)等鞭金藻的生長(zhǎng),而綠光更有利于生物活性物質(zhì)的積累。今后可采用兩步法(先用白光培養(yǎng)再用綠光培養(yǎng))培養(yǎng)等鞭金藻,研究是否可顯著提高等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)與生物活性物質(zhì)的合成,促進(jìn)等鞭金藻生物活性物質(zhì)規(guī)模化生產(chǎn)。