海洋真菌Aspergillus terreus次生代謝產(chǎn)物研究

李思敏,周金彩,何 蓉,唐穎楠,周思倩,王雅靜,龍紅萍*

1湖南科技職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院,長(zhǎng)沙 410004;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410007;3湖南中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)沙 410208

近年來(lái),海洋天然產(chǎn)物吸引了全世界的化學(xué)家和生物學(xué)家的關(guān)注,目前已從海洋生物中分離鑒定出1.6萬(wàn)多種海洋天然產(chǎn)物,海洋微生物被認(rèn)為是生產(chǎn)新型抗生素、抗腫瘤和抗炎藥物的寶貴來(lái)源[1]。海洋真菌特別是與海洋藻類、海綿、無(wú)脊椎動(dòng)物和沉積物相關(guān)的真菌是生物活性次代謝產(chǎn)物的有效生成者,由于它們?cè)跍囟?、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)和鹽度等方面的特性,與陸生真菌相比形成了特定的次級(jí)代謝途徑,能產(chǎn)生豐富的新活性天然產(chǎn)物[2],這些新穎結(jié)構(gòu)次生代謝物在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3,4]。

曲霉屬真菌是地球上分布最廣泛的真菌群之一,包含約300～350多種真菌[5]。目前從曲霉屬真菌中發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)類型的次生代謝產(chǎn)物,如生物堿類、萜類、木質(zhì)素類、甾體、聚酮類、環(huán)肽類等,且具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種生物活性[6]。土曲霉廣泛存在于自然界中,常被從土壤的根際[7]、腐爛的有機(jī)物[8]和海洋環(huán)境[9]中分離出來(lái),除能夠產(chǎn)生降脂藥洛伐他汀及其中間體外,土曲霉還能產(chǎn)生多種具有經(jīng)濟(jì)意義的次生代謝物。同一種菌,因來(lái)源不同,所處環(huán)境不同,其次生代謝產(chǎn)物亦不相同。本研究選取來(lái)源于南沙群島海域海泥中分離得到的一株土曲霉為研究對(duì)象,并采用大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵,對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,并進(jìn)行低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的體外神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià),以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和活性較好的代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步豐富曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Agilent 6500 Q-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定(美國(guó)安捷倫科技有限公司);旋光數(shù)據(jù)由Autopol II型自動(dòng)旋光儀測(cè)定(美國(guó)魯?shù)婪蚬?;核磁數(shù)據(jù)由Bruker AV-500 MHz和AV-600 MHz核磁共振儀測(cè)定(美國(guó)布魯克儀器有限公司),以TMS作為內(nèi)標(biāo);分析型HPLC為Agilent 1260(美國(guó)安捷倫科技有限公司);制備型HPLC為EClassical P3500(大連依利特儀器有限公司);LDZM-60L高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司);Enspire多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司);IX71熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);LSM800激光共聚焦(德國(guó)卡爾·蔡司有限公司);Sephadex LH-20凝膠(瑞典法瑪西亞公司);D101大孔吸附樹脂(天津浩聚樹脂有限公司);柱層析硅膠200～300目(青島海洋化工廠);HS-GF254薄層層析硅膠板(煙臺(tái)江有硅膠開發(fā)有限公司);PC12細(xì)胞(批號(hào):CL-0481,武漢普諾賽生命科技有限公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào):61870036,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司,);Gibco胎牛血清(批號(hào):10100147,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);CCK-8試劑盒(批號(hào):BA00208,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);胰酶(批號(hào):25200114,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 菌種來(lái)源

菌株土曲霉是從中國(guó)南沙群島海域海泥中分離純化得到,其DNA擴(kuò)增和ITS序列由北京擎科生物科技有限公司測(cè)定,并經(jīng)過(guò)BLAST對(duì)比,發(fā)現(xiàn)與菌株Aspergillusterreus(Genbank accession No.MF152908.1)的18S rRNA序列和ITS序列99.31%相似,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,將該菌株鑒定為土曲霉,并保藏于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心(編號(hào):CXJ-38)。

1.3 菌種的發(fā)酵與提取分離

將目標(biāo)菌株接種到PDA平板上活化,室溫下培養(yǎng)5～7 d,活化的真菌用刀片切取適量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中,在室溫和150 r/min培養(yǎng)5 d后作為種子液。取500 mL錐形瓶50個(gè),每瓶裝100 g大米和100 mL水,于121 ℃滅菌30 min作為固體發(fā)酵培養(yǎng)基。向每瓶固體培養(yǎng)基中加入10 mL種子液,室溫下,靜置避光培養(yǎng)30 d。

固體發(fā)酵物用乙酸乙酯提取3次,減壓濃縮得浸膏71 g。浸膏用大孔吸附樹脂(D101)分段,分別用水、80%甲醇水、甲醇洗脫。80%甲醇水洗脫部位進(jìn)一步用硅膠柱分離,分別用石油醚-乙酸乙酯-甲醇洗脫(10∶1∶0、7∶1∶0、5∶1∶0、2∶1∶0、1∶1∶0、1∶1∶0.2),合并后得10個(gè)組分(Fr.A～J)。組分Fr.D 通過(guò)凝膠柱色譜和半制備液相(40%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min)純化得到化合物5(5.2 mg,tR=18.8 min)、6(3.8 mg,tR=21.2 min)、7(4.5 mg,tR= 24.0 min)和13(3.6 mg,tR= 25.7 min)。組分Fr.E通過(guò)凝膠柱色譜和半制備液相(25%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進(jìn)樣量為0.1 mL,檢測(cè)器為VWD,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm)純化得到化合物10(2.5 mg,tR=10.6 min)、11(3.0 mg,tR=11.6 min)、12(3.5 mg,tR=13.0 min)。組分Fr.F 通過(guò)凝膠柱色譜和半制備液相(35%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進(jìn)樣量為0.1 mL,檢測(cè)器為VWD,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm)純化得到化合物1(3.5 mg,tR=18.6 min)、3(3.2 mg,tR=23.8 min)和8(4.3 mg,tR=26.9 min)。組分Fr.G 通過(guò)凝膠柱色譜和半制備液相(30%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進(jìn)樣量為0.1 mL,檢測(cè)器為VWD,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm)純化得到化合物2(3.3 mg,tR=19.2 min)、4(2.8 mg,tR=20.5 min)和9(3.6 mg,tR=25.4 min)。

1.4 神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià)

對(duì)化合物1～13進(jìn)行低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的活性評(píng)價(jià),取PC12細(xì)胞,在37 ℃、1640培養(yǎng)液、5% CO2培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng),接種于24孔板中,培養(yǎng)24 h。將PC12細(xì)胞進(jìn)行低氧/復(fù)氧處理后(缺氧3 h后,復(fù)氧同時(shí)給藥干預(yù)24 h,給藥劑量為1 μmol/L和0.1 μmol/L)。PBS輕輕潤(rùn)洗2次,每孔加入細(xì)胞固定液0.3 mL,室溫固定細(xì)胞45 min。棄液,用PBS洗2次,每孔加入0.25%Triton-100液0.2 mL,室溫處理10 min。棄液,用PBS洗2次,每孔加入0.2 mL Hoechst染色液(1∶400),室溫浸染細(xì)胞15 min。棄液,PBS洗滌細(xì)胞3次,于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,向每孔加入10 μL CCK-8溶液,混合均勻,在37 ℃孵育3 h,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm下的吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用t檢驗(yàn)確定顯著性水平,若P<0.05則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3白色粉末;HR-ESI-MS:m/z383.146 8[M+H]+,分子式為C22H22O6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.45(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′/H-6′),6.93(1H,d,J=8.3 Hz,H-6′′),6.92(1H,s,H-2′′),6.79(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′/H-5′),6.65(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′′),6.51(1H,s,H-4),3.75(2H,s,H-5),3.72(1H,dd,J= 7.3,5.4 Hz,H-8′′),2.92,(1H,dd,J=16.6,5.4 Hz,Ha-7′′),2.64(1H,dd,J=16.6,7.2 Hz,Hb-7′′),1.29(3H,s,H-10′′),1.22(3H,s,H-11′′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:175.3(s,C-1),125.3(s,C-2),158.5(s,C-3),100.0(d,C-4),30.1(t,C-5),122.6(s,C-1′),131.7(d,C-2′/C-6′),117.0(d,C-3′/C-5′),162.2(s,C-4′),130.6(s,C-1′′),130.3(d,C-2′′),121.4(s,C-3′′),152.9(s,C-4′′),118.1(d,C-5′′),128.3(d,C-6′′),32.1(t,C-7′′),70.5(d,C-8′′),77.9(s,C-9′′),25.8(q,C-10′′),21.1(q,C-11′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致,其旋光值為零,推測(cè)為外消旋體,因此鑒定化合物為(±)-asperteretal F。

化合物4白色粉末;HR-ESI-MS:m/z365.164 3[M+H]+,分子式為C22H22NO4;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.42(2H,d,J=8.7 Hz,H-2′/H-6′),6.83(1H,s,H-2′′),6.82(2H,d,J=8.7 Hz,H-3′/H-5′),6.81(1H,d,J=7.5 Hz,H-6′′),6.65(1H,d,J=7.7 Hz,H-5′′),5.24(1H,m,H-8′′),3.76(2H,s,H-6),3.20(1H,d,J=7.4 Hz,H-7′′),1.71(3H,s,H-10′′),1.65(3H,s,H-11′′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:174.1(s,C-2),139.4(s,C-3),138.4(s,C-4),174.8(s,C-5),29.5(t,C-6),121.5(s,C-1′),132.4(d,C-2′/C-6′),116.4(d,C-3′/C-5′),160.4(s,C-4′),129.6(s,C-1′′),130.3(d,C-2′′),129.4(s,C-3′′),154.7(s,C-4′′),115.9(d,C-5′′),127.5(d,C-6′′),28.9(t,C-7′′),123.7(d,C-8′′),133.3(s,C-9′′),17.8(q,C-10′′),25.9(q,C-11′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物為asperimide A。

化合物5白色粉末;HR-ESI-MS:m/z405.263 0[M+H]+,分子式為C24H36O5;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.97(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.76(1H,dd,J=9.6,6.0 Hz,H-3),5.51(1H,br s,H-5),5.36(1H,br d,J=3.4 Hz,H-8),4.61(1H,m,H-11),4.35(1H,m,H-13),2.72(1H,dd,J= 17.7,5.2 Hz,Hb-14),3.20(1H,d,J=17.7 Hz,Ha-14),2.44(1H,m,H-6),2.35(2H,m,overlapped,H-2/H-2′),2.25(1H,br d,J=12.3 Hz,H-8a),1.81～1.97(4H,m,overlapped,Hb-10,Hb-12,Ha-7,Hb-7),1.61～1.71(3H,m,overlapped,Hb-3′,H-1,Ha-12),1.34～1.51(3H,m,overlapped,Ha-9,Hb-9,Ha-3′),1.27(3H,m,Ha-10),1.09(3H,d,J=6.9 Hz,2′-CH3),1.06(3H,d,J=7.4 Hz,6-CH3),0.88(3H,d,J= 7.0 Hz,2-CH3),0.87(3H,t,J=7.5 Hz,H-4′);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:36.7(d,C-1),30.8(d,C-2),14.0(q,2-CH3),133.2(d,C-3),128.4(d,C-4),131.7(s,C-4a),129.8(d,C-5),27.6(d,C-6),23.0(q,6-CH3),32.8(t,C-7),68.0(d,C-8),37.4(d,C-8a),24.4(t,C-9),33.1(t,C-10),76.5(d,C-11),36.2(t,C-12),62.7(d,C-13),38.7(t,C-14),170.7(s,C-15),177.1(s,C-1′),41.6(d,C-2′),26.9(t,C-3′),11.9(q,C-4′),16.4(q,2′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物為洛伐他汀。

化合物6白色粉末;HR-ESI-MS:m/z489.211 0[M+H]+,分子式為C26H32O9;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.15(1H,s,6-OH),5.46(1H,s,Ha-22),5.08(1H,s,Hb-22),3.79(3H,s,H-1′),3.54(1H,s,H-14),2.95(1H,br d,J=13.9 Hz,Ha-11),2.69(1H,dd,J=19.1,8.5 Hz,Ha-2),2.52(1H,m,Hb-2),2.35(1H,m,Ha-1),2.26(1H,br d,J=14.4 Hz,Hb-11),1.93(3H,s,H-20),1.76(1H,m,Hb-1),1.71(3H,s,H-24),1.47(3H,s,H-23),1.47(3H,s,H-18),1.44(3H,s,H-19),1.21(3H,s,H-21);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:28.0(t,C-1),32.6(t,C-2),214.1(s,C-3),47.8(s,C-4),131.5(s,C-5),138.6(s,C-6),196.9(s,C-7),52.3(s,C-8),77.5(s,C-9),43.0(s,C-10),34.8(t,C-11),139.7(s,C-12),49.4(s,C-13),44.5(d,C-14),167.7(s,C-15),85.4(s,C-16),201.4(s,C-17),21.1(q,C-18),23.5(q,C-19),19.7(q,C-20),18.5(q,C-21),117.1(t,C-22),23.3(q,C-23),21.2(q,C-24),168.5(s,C-25),53.7(q,25-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物為terretonin。

化合物7白色粉末;HR-ESI-MS:m/z466.160 5[M+H]+,分子式為C24H23N3O7;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:9.23(1H,s,H-2′),8.83(1H,d,J=8.4 Hz,H-3),8.71(1H,d,J=3.9 Hz,H-4′),8.26(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),7.91(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),7.61(1H,m,H-4),7.38(1H,dd,J= 7.8,4.7 Hz,H-5′),7.28(1H,s,H-6′′),7.24(1H,m,H-5),3.98(3H,s,4′′-OCH3),3.92(3H,s,3′′-OCH3),3.91(3H,s,5′′-OCH3),3.83(3H,s,7′′-OCH3);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:120.1(s,C-1),140.1(s,C-2),121.5(d,C-3),133.4(d,C-4),123.6(d,C-5),127.7(d,C-6),168.0(s,C-7),130.4(s,C-1′),149.0(d,C-2′),152.3(d,C-4′),123.4(d,C-5′),135.0(d,C-6′),163.8(s,C-7′),118.8(s,C-1′′),125.5(s,C-2′′),148.6(s,C-3′′),146.6(s,C-4′′),151.2(s,C-5′′),108.5(d,C-6′′),167.0(s,C-7′′),61.0(q,3′′-OCH3),61.0(q,4′′-OCH3),56.2(q,5′′-OCH3),52.5(q,7′′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,因此鑒定化合物為methyl-3,4,5-trimethoxyl-2-(2-(nicotinamide)benzamido) benzoate。

化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 活性評(píng)價(jià)結(jié)果

化合物1～13對(duì)低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,與模型組相比,當(dāng)藥物濃度為1 μmol/L和0.1 μmol/L,化合物1、3、5、6和7能顯著降低細(xì)胞凋亡率和提高細(xì)胞存活率,化合物8、12和13具有明顯地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促使其凋亡的作用,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);化合物2、9和11未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響,無(wú)顯著性差異(見圖2和圖3)。土曲霉次生代謝產(chǎn)物1、3、5、6和7能顯著減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生的細(xì)胞損傷,呈現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護(hù)的活性。

圖2 不同濃度化合物1～13對(duì)OGD/R處理的PC12細(xì)胞活力的影響

圖3 不同濃度化合物1～13對(duì)OGD/R處理的PC12細(xì)胞凋亡的影響

3 結(jié)論

本研究利用大孔吸附樹脂、硅膠、凝膠柱色譜及半制備液相等方法對(duì)海洋來(lái)源土曲霉的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化,從中分離鑒定出13個(gè)化合物,其中化合物1～3是γ-丁內(nèi)酯衍生物,化合物4是一類海洋天然生物堿馬來(lái)酰亞胺(2,5-吡咯二酮)衍生物,化合物5是他汀類藥物洛伐他汀,化合物6是萜類化合物,化合物7是苯甲酸甲酯類化合物,首次報(bào)道了它的核磁數(shù)據(jù),化合物8～12是5個(gè)二酮哌嗪類化合物,其中化合物8和9為硫代二酮哌嗪,化合物13是苯并吡喃酮類化合物。初步的體外神經(jīng)保護(hù)活性測(cè)試表明化合物1、3、5、6和7能顯著減少氧化應(yīng)激產(chǎn)生的細(xì)胞損傷,本文研究了土曲霉大米發(fā)酵物的次生代謝產(chǎn)物及單體化合物的神經(jīng)保護(hù)活性,為后期深入挖掘土曲霉次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性提供了科學(xué)參考依據(jù)。