五嶺龍膽化學成分及其抗炎活性研究

彭江麗,王 鵬,彭求賢,李 娟*,李順祥*

1湖南中醫(yī)藥大學藥學院;2湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心;3湖南省中美老年性退行性疾病治療藥物國際聯合研究中心,長沙410208

五嶺龍膽為龍膽科龍膽屬五嶺龍膽(GentianadavidiiFranch.)的全草[1],生于350～2 500 m的山坡草叢及林下,主要分布于湖南、浙江、福建和江西等地,夏或秋季采收,洗凈,曬干或鮮用。據清代《文堂集驗方》和《全國中草藥匯編》記載,五嶺龍膽又名九頭青[2],《中華本草》中又稱其為落地荷花[3],并在各地民族醫(yī)藥書籍中均有所記載。其味苦,性寒,具有清熱解毒、利濕的功效,主治小兒驚風、目赤、咽痛、肝炎、痢疾、淋證、化膿性骨髓炎、癰瘡腫毒和毒蛇咬傷[2]。五嶺龍膽作為民間用藥,其用藥歷史悠久、療效顯著,主要用于治療肺熱咳嗽[4]、子宮內膜炎[5]和化膿性骨髓炎[6]等炎癥相關疾病,但目前其化學成分和藥理作用研究比較薄弱。同屬植物龍膽研究報道[7]較多,其主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類和三萜類等成分[8],所含成分具有抗炎、保肝和抗氧化等藥理活性[9]。本實驗根據龍膽的研究基礎,采用柱色譜、波譜技術和細胞活性篩選方法,研究五嶺龍膽抗炎藥效物質基礎,為五嶺龍膽藥材的開發(fā)提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

INOVA-600MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);HR-ESI-TOF-MS光譜儀(美國Agilent公司);Varioskan LUX多功能酶標儀(Thermo 公司);TS2倒置生物顯微鏡(日本尼康公司);3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技有限公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠填料(瑞士GE Healthcare公司);反相ODS柱填料(日本YMC公司);甲醇等試劑均為分析純(湖南匯虹試劑有限公司);胎牛血清(批號:164210-50)、DMEM高糖培養(yǎng)基(批號:PM150210)、PBS磷酸緩沖液(批號:PB180327)和胰蛋白酶(批號:SV300371)(Hyclone公司);噻唑藍(批號:M2128)、脂多糖(批號:L2630)和二甲基亞砜(批號:D2650)(Sigma公司);NO Griess試劑盒(批號S0021M,南京碧云天生物科技有限公司);地塞米松(dexamethasone,DXMS)(批號D8041,純度>98.5%,北京索萊寶科技有限公司);小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7)(批號CL-0190,武漢普諾賽生命科技有限公司)。

五嶺龍膽于2019年12月采自湖南省瀏陽大圍山,經中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為龍膽科植物五嶺龍膽(GentianadavidiiFranch.)全草,憑證標本(20191211)保存于湖南中醫(yī)藥大學中藥活性物質篩選工程技術研究中心。

1.2 實驗與方法

1.2.1 提取分離

五嶺龍膽干燥全草(7.5 kg),粉碎成粗粉,加入適量70%乙醇浸潤,裝入滲漏裝置中,70%乙醇洗脫至滲濾液無色。藥渣繼續(xù)用70%乙醇回流提取二次,合并滲漏液與提取液,50 ℃減壓濃縮至無醇味,得五嶺龍膽提取物(1.2 kg)。提取物加適量蒸餾水使懸浮,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次,每次加入2 L溶劑,分別合并不同極性萃取液,50 ℃減壓濃縮,制得石油醚萃取部位(浸膏30.0 g)、乙酸乙酯萃取部位(浸膏150.0 g)、正丁醇萃取部位(浸膏135.0 g)和水層(浸膏約500.0 g)。

乙酸乙酯萃取部位(150.0 g)加適量乙酸乙酯溶解,硅膠(80～100目)拌樣后上樣,裝進硅膠柱色譜(硅膠柱7.0 cm×60.0 cm)上,用石油醚-乙酸乙酯系統(30∶1→10∶1→5∶1→1∶1→0∶1)梯度洗脫,得到5個流分(Fr.1～Fr.5)。Fr.1(8.3 g)經反復硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱及重結晶,分離得到化合物3(5.5 mg)、8(4.5 mg)和12(10.3 mg)。Fr.2(22.5 g)經硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯(7∶1)系統等度洗脫,得到10個流分(Fr.2.1～Fr.2.10);Fr.2.1經反復硅膠柱分離得化合物6(5.7 mg)和14(10.1 mg);Fr.2.5經反復硅膠柱分離得化合物4(10.4 mg)和5(40.2 mg);Fr.2.7經ODS柱,甲醇-水(20%→100%)系統梯度洗脫,分離得到化合物1(6.1 mg)和2(5.2 mg)。Fr.4(4.9 g)經ODS柱,甲醇-水(20%→100%)系統梯度洗脫,得到10個流分;Fr.4.5經反復硅膠柱和Sephadex LH-20 凝膠柱分離,得到化合物11(5.7 mg);Fr.4.7經硅膠柱層析,三氯甲烷-甲醇(7∶1)系統等度洗脫,得到化合物7(4.3 mg)。Fr.5(23.6 g)經ODS柱,甲醇-水(20%→100%)系統梯度洗脫,得到10個流分;Fr.5.2經硅膠柱層析,三氯甲烷-甲醇(8∶1)系統等度洗脫,得到化合物9(6.9 mg);Fr.5.3經反復ODS柱和硅膠柱分離得化合物15(7.4 mg);Fr.5.8組分經反復硅膠柱層析,分離得到10(7.2 mg)。正丁醇萃取部位(135.0 g)用適量正丁醇溶解,硅膠(80～100目)拌樣后上樣,裝入已干法裝柱的硅膠柱(8.0 cm×55.0 cm)上,用二氯甲烷-甲醇(30∶1→10∶1→5∶1→1∶1→0∶1)系統梯度洗脫,得到5個流分(Fr.A～Fr.E);Fr.B(4.3 g)經ODS柱,甲醇-水(20%→100%)系統梯度洗脫,得到10個流分。Fr.B.3經Sephadex LH-20 凝膠柱和硅膠柱分離,得到化合物13(7.9 mg)。

1.2.2 抗炎活性篩選

不同化合物對RAW 264.7細胞的毒性作用。取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的RAW 264.7細胞,用DMEM完全培養(yǎng)基配制成單細胞懸液,細胞計數,以3×105個/mL,每孔100 μL均勻接種于96孔板中,于37 ℃,5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設置空白組不加細胞、對照組加入含細胞的DMEM完全培養(yǎng)基、樣品組加入不同濃度(1、10、25、50和100 μmol/L)化合物的DMEM完全培養(yǎng)基,每組3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入20 μL MTT,培養(yǎng)4 h,棄去液體,加入150 μL DMSO溶液,低速振蕩10 min后,酶標儀490 nm測定各孔吸光值(OD值),計算細胞存活率。計算公式為:細胞存活率=[(樣品組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

不同化合物對LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO釋放量的影響。采用LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥模型,分別設置空白組(無細胞)、對照組(僅DMEM培養(yǎng)基)、模型組(1 μg/mL LPS)[10]、陽性藥物組(1 μg/mL LPS +1、10、25和50 μmol/L地塞米松)、實驗組(1 μg/mL LPS+1、10、25和50 μmol/L化合物1～15)每組3個復孔。培養(yǎng)24 h,取其上清液于離心管中,采用Griess試劑盒說明書中操作方法,按步驟順序加入各試劑,檢測細胞培養(yǎng)液中NO的含量,根據標準曲線計算各組濃度。將各劑量和抑制率等參數用非線性回歸擬合計算IC50[11]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1無色針狀結晶(三氯甲烷);mp.273～275 ℃;ESI-MS:m/z455[M-H]-,分子式為C30H48O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.18(1H,t,J= 3.6 Hz,H-12),3.60(1H,m,H-3),2.15(1H,d,J= 10.8 Hz,H-18),0.98(3H,s,H-23),0.95(3H,d,J= 6.1 Hz,H-29),0.91(3H,s,H-27),0.88(3H,s,H-26),0.82(3H,d,J= 6.1 Hz,H-30),0.78(3H,s,H-24),0.73(3H,s,H-25);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.2(C-1),27.0(C-2),79.0(C-3),39.0(C-4),55.6(C-5),18.0(C-6),33.3(C-7),42.4(C-8),47.8(C-9),37.2(C-10),23.5(C-11),125.8(C-12),138.5(C-13),39.7(C-14),28.2(C-15),23.7(C-16),48.1(C-17),53.1(C-18),37.1(C-19),39.7(C-20),31.0(C-21),39.4(C-22),28.3(C-23),15.6(C-24),15.8(C-25),17.1(C-26),23.5(C-27),181.0(C-28),17.2(C-29),21.3(C-30)。以上數據與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物1為熊果酸。

化合物2無色針狀結晶(乙酸乙酯);mp.208～210 ℃;ESI-MS:m/z441[M-H]-,分子式為C30H50O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.16(1H,t,J= 3.6 Hz,H-12),3.56(1H,d,J= 10.8 Hz,H-28a),3.25(1H,dd,J= 10.8,3.6 Hz,H-3),3.22(1H,d,J= 10.8 Hz,H-28b),1.36(3H,s,H-27),1.31(3H,s,H-26),1.13(3H,s,H-25),0.97(3H,s,H-23),0.96(3H,d,J= 6.0 Hz,H-29),0.83(3H,d,J= 6.0 Hz,H-30),0.82(3H,s,H-24);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.9(C-1),28.3(C-2),79.2(C-3),38.2(C-4),55.3(C-5),18.5(C-6),31.6(C-7),40.2(C-8),47.8(C-9),35.3(C-10),26.2(C-11),125.2(C-12),138.9(C-13),42.2(C-14),27.4(C-15),23.5(C-16),37.0(C-17),54.2(C-18),39.6(C-19),39.5(C-20),30.8(C-21),32.9(C-22),30.3(C-23),15.8(C-24),15.8(C-25),17.5(C-26),23.5(C-27),70.1(C-28),16.9(C-29),21.5(C-30)。以上數據與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物2為烏發(fā)醇。

化合物3白色粉末;ESI-MS:m/z485[M-H+HCOOH]-,分子式為C30H48O2;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.31(1H,d,J= 1.1 Hz,H-28),5.30(1H,t,J= 3.5 Hz,H-12),3.20(1H,dd,J= 11.4,4.9 Hz,H-3),1.08(3H,s,H-27),0.97(3H,s,H-23),0.95(3H,d,J= 6.5 Hz,H-30),0.91(3H,s,H-26),0.86(3H,d,J= 6.5 Hz,H-29),0.77(3H,s,H-25),0.75(3H,s,H-24);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.8(C-1),28.3(C-2),79.1(C-3),38.8(C-4),55.3(C-5),18.4(C-6),33.2(C-7),38.9(C-8),47.7(C-9),37.1(C-10),23.4(C-11),126.3(C-12),137.9(C-13),42.3(C-14),27.3(C-15),27.0(C-16),50.3(C-17),52.7(C-18),39.9(C-19),39.1(C-20),30.3(C-21),32.0(C-22),29.8(C-23),16.8(C-24),15.6(C-25),17.3(C-26),23.4(C-27),207.6(C-28),15.8(C-29),21.2(C-30)。以上數據與文獻[14]報道基本一致,故鑒定化合物3為ursaldehyde。

化合物4白色粉末;ESI-MS:m/z457[M-H+HCOOH]-,分子式為C29H48O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.31(1H,t,J= 3.3 Hz,H-12),3.25(1H,dd,J= 12.3,4.7 Hz,H-3),2.85(1H,dd,J= 13.4,4.2 Hz,H-18),0.98(3H,s,H-23),0.97(3H,d,J= 7.2 Hz,H-28),0.95(3H,s,H-27),0.94(3H,s,H-26),0.90(3H,d,J= 7.2 Hz,H-29),0.80(3H,s,H-25),0.78(3H,s,H-24);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.5(C-1),23.5(C-2),79.1(C-3),37.2(C-4),55.3(C-5),18.4(C-6),32.7(C-7),38.9(C-8),46.1(C-9),33.9(C-10),26.1(C-11),123.1(C-12),139.01(C-13),39.4(C-14),28.2(C-15),27.3(C-16),47.7(C-17),46.7(C-18),41.2(C-19),41.8(C-20),30.8(C-21),33.2(C-22),32.7(C-23),17.2(C-24),15.5(C-25),15.7(C-26),27.8(C-27),23.7(C-28),23.1(C-29)。以上數據與文獻[15]報道基本一致,故鑒定化合物4為28-norurs-12-en-3β-ol。

化合物5白色粉末;ESI-MS:m/z501[M-H+HCOOH]-,分子式為C30H48O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.23(1H,t,J= 3.4 Hz,H-12),3.20(1H,dd,J= 11.4,4.9 Hz,H-3),2.80(1H,dd,J= 13.9,4.1 Hz,H-18),1.12(3H,s,H-27),0.95(3H,s,H-23),0.90(3H,s,H-25),0.89(3H,s,H-30),0.87(3H,s,H-29),0.77(3H,s,H-24),0.74(3H,s,H-26);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.1(C-1),27.2(C-2),79.2(C-3),39.2(C-4),55.9(C-5),18.9(C-6),33.1(C-7),39.8(C-8),48.2(C-9),37.5(C-10),23.8(C-11),122.9(C-12),144.4(C-13),42.3(C-14),28.2(C-15),23.9(C-16),46.9(C-17),41.9(C-18),46.5(C-19),31.1(C-20),34.4(C-21),33.3(C-22),28.4(C-23),15.9(C-24),15.6(C-25),17.2(C-26),26.2(C-27),181.3(C-28),33.4(C-29),23.5(C-30)。以上數據與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物5為齊墩果酸。

化合物6白色粉末;ESI-MS:m/z485[M-H+HCOOH]-,分子式為C39H68O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.15(1H,t,J= 3.2 Hz,H-12),3.67(2H,t,J= 4.9 Hz,H-1′),3.20(1H,dd,J= 11.9,4.7 Hz,H-3),1.45～1.23(14H,m,H-2′～H-8′),1.09(3H,s,H-27),1.03(3H,s,H-28),1.02(3H,s,H-23),0.98(3H,s,H-25),0.95(3H,s,H-30),0.90(3H,s,H-29),0.87(3H,t,J= 4.9 Hz,H-9′),0.82(3H,s,H-24),0.81(3H,s,H-26);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.9(C-1),23.5(C-2),79.2(C-3),37.1(C-4),55.2(C-5),18.5(C-6),32.1(C-7),39.8(C-8),41.5(C-9),33.9(C-10),17.6(C-11),122.5(C-12),142.3(C-13),40.1(C-14),29.8(C-15),27.4(C-16),59.1(C-17),47.8(C-18),39.7(C-19),41.7(C-20),31.4(C-21),42.2(C-22),28.2(C-23),16.9(C-24),15.8(C-25),15.7(C-26),23.4(C-27),22.8(C-28),14.3(C-29),21.5(C-30),63.2(C-1′),26.7(C-2′),25.9(C-3′),28.3(C-4′),28.9(C-5′),29.8(C-6′),32.9(C-7′),23.5(C-8′),15.8(C-9′)。以上數據與文獻[16]報道基本一致,故鑒定化合物6為β-amyrin-n-nonyl ether。

化合物7無色針狀結晶(甲醇);mp.235～237 ℃,ESI-MS:m/z198[M-H]-,分子式為C10H14O4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.78(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),6.72(1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.65(1H,dd,J= 7.8,1.8 Hz,H-6),3.83(3H,s,H-3-OCH3),3.80(1H,m,H-8),3.51(1H,dd,J= 10.8,4.2 Hz,H-9a),3.43(1H,dd,J= 10.8,6.6 Hz,H-9b),2.71(1H,dd,J= 13.8,6.0 Hz,H-7a),2.61(1H,dd,J= 13.8,7.2 Hz,H-7b);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:130.9(C-1),113.6(C-2),148.2(C-3),145.3(C-4),115.7(C-5),122.5(C-6),40.1(C-7),74.2(C-8),66.2(C-9),56.1(3-OCH3)。以上數據與文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物7為vanillyl glycol。

化合物8白色粉末;ESI-MS:m/z437[M+Na]+,分子式為C29H50O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.38(1H,d,J= 5.1 Hz,H-6),3.73(1H,m,H-7),3.55(1H,m,H-3),1.13(3H,d,J= 6.6 Hz,H-21),1.03(3H,s,H-19),0.95(3H,d,J= 7.2 Hz,H-29),0.87(3H,d,J= 7.1 Hz,H-26),0.86(3H,d,J= 6.6 Hz,H-27),0.82(3H,s,H-18);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.9(C-1),32.1(C-2),71.9(C-3),42.4(C-4),140.9(C-5),121.9(C-6),31.8(C-7),29.3(C-8),50.3(C-9),37.4(C-10),21.2(C-11),40.6(C-12),45.9(C-13),56.2(C-14),24.5(C-15),28.4(C-16),56.9(C-17),12.0(C-18),19.9(C-19),36.7(C-20),19.2(C-21),34.1(C-22),26.2(C-23),40.7(C-24),29.1(C-25),19.6(C-26),18.9(C-27),23.2(C-28),12.1(C-29)。以上數據與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物8為β-谷甾醇。

化合物9白色粉末;ESI-MS:m/z599[M+Na]+,分子式為C35H60O6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.33(1H,d,J= 7.8 Hz,H-6),5.07(1H,m,H-1′),4.37(1H,d,J= 7.8 Hz,H-3),3.82～3.80(2H,m,H-6′),1.18(3H,d,J= 6.5 Hz,H-21),1.03(3H,s,H-19),0.95(3H,s,H-29),0.91(3H,d,J= 7.1 Hz,H-26),0.87(3H,d,J= 6.8 Hz,H-27),0.81(3H,s,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:38.5(C-1),29.5(C-2),78.9(C-3),42.2(C-4),140.3(C-5),121.9(C-6),33.8(C-7),31.8(C-8),50.2(C-9),37.2(C-10),20.9(C-11),39.7(C-12),45.8(C-13),56.7(C-14),24.2(C-15),28.1(C-16),55.9(C-17),11.6(C-18),18.7(C-19),36.6(C-20),18.5(C-21),36.1(C-22),25.9(C-23),49.3(C-24),29.1(C-25),19.1(C-26),19.5(C-27),22.9(C-28),11.6(C-29),101.08(C-1′),73.6(C-2′),76.5(C-3′),70.2(C-4′),76.1(C-5′),61.6(C-6′)。以上數據[19]與文獻報道基本一致,故鑒定化合物9為β-胡蘿卜苷。

化合物10白色粉末;ESI-MS:m/z601[M-H]-,分子式為C37H62O6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.33(1H,d,J= 5.4 Hz,H-6),4.37(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),3.81～3.80(2H,m,H-6′),1.22(3H,s,H-31),0.99(3H,s,H-18),0.89(3H,d,J= 6.0 Hz,H-24),0.85(3H,d,J= 7.2 Hz,H-28),0.80(3H,t,J= 6.9 Hz,H-30),0.65(3H,s,H-19);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:37.6(C-1),29.4(C-2),79.4(C-3),42.7(C-4),140.7(C-5),122.4(C-6),32.3(C-7),30.0(C-8),50.6(C-9),34.3(C-10),21.4(C-11),46.2(C-12),40.1(C-13),57.1(C-14),24.6(C-15),56.4(C-16),49.6(C-17),19.6(C-18),12.1(C-19),26.3(C-20),28.6(C-21),23.4(C-22),37.1(C-23),12.1(C-24),20.0(C-25),36.5(C-26),39.0(C-27),19.2(C-28),29.9(C-29),18.9(C-30),32.2(C-31),101.5(C-1′),73.9(C-2′),76.9(C-3′),70.6(C-4′),76.3(C-5′),62.1(C-6′)。以上數據與文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物10為anemarrhenoside B。

化合物11白色無定型粉末;ESI-MS:m/z365[M-H]-,分子式為C26H54;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.27～1.29(44H,m,H-3～H-24),0.86(6H,m,H-1,H-26);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:32.3(C-1),30.1(C-2),30.0～29.9(C-3～C-23),29.7(C-24),23.1(C-25),14.3(C-26)。以上數據與文獻[21]報道基本一致,故鑒定化合物11為正二十六烷。

化合物12白色無定型粉末;ESI-MS:m/z434[M-H2O]+,406[M-H2O-C2H4]+,392[M-H2O-C2H4-C2H4]+,分子式為C31H64O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:3.56(2H,t,J= 6.6 Hz,H-1),1.55(2H,m,H-2),1.27～1.31(56H,m,H-3～H-30),0.88(3H,t,J= 7.2 Hz,H-31);13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:61.8(C-1),32.1(C-2),31.5(C-3),29.2～28.9(C-4～C-28),25.4(C-29),22.2(C-30),13.3(C-31)。以上數據與文獻[22]報道基本一致,故鑒定化合物12為正三十一烷醇。

化合物13白色粉末;ESI-MS:m/z515[M-H]-,分子式為C24H36O12;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.11(1H,d,J= 8.4 Hz,H-3),6.92(1H,dd,J= 9.0,3.0 Hz,H-4),6.91(1H,d,J= 2.4 Hz,H-6),5.34(1H,t,J= 7.2 Hz,H-2′),4.82(1H,d,J= 7.2 Hz,H-1′′),4.80(1H,d,J= 7.2 Hz,H-1′′′),4.07(1H,dd,J= 14.4,7.2 Hz,H-6a′′′),3.90(1H,dd,J= 11.8,1.8 Hz,H-6a′′),3.75(1H,dd,J= 11.8,1.8 Hz,H-6b′′),3.71(1H,dd,J= 13.2,6.9 Hz,H-6b′′′),3.39(2H,m,H-1′),1.76(3H,s,H-5′),1.73(3H,s,H-4′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:152.1(C-1),133.7(C-2),117.5(C-3),115.7(C-4),154.4(C-5),119.0(C-6),29.2(C-1′),123.7(C-2′),133.5(C-3′),25.9(C-4′),17.9(C-5′),103.4(C-1′′),75.0(C-2′′),78.2(C-3′′),71.3(C-4′′),77.9(C-5′′),62.5(C-6′′),103.0(C-1′′′),74.8(C-2′′′),77.9 (C-3′′′),71.2(C-4′′′),78.0(C-5′′′)和62.4(C-6′′′)。以上數據與文獻[23]報道基本一致,故鑒定化合物13為1,5-bis-β-D-glucopyranosyloxy-2-(3′,3′-dimethylallyl)benzene。

化合物14淡黃色針晶(三氯甲烷);mp.51～53℃;ESI-MS:m/z205[M-H]-,分子式為C14H22O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.35(1H,d,J= 2.5 Hz,H-3),7.12(1H,dd,J= 8.2,2.3 Hz,H-5),6.62(1H,d,J= 8.2 Hz,H-6),1.47(9H,s,H-12～H-14),1.34(9H,s,H-8～H-10);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:151.9(C-1),135.4(C-2),123.7(C-3),143.1(C-4),124.2(C-5),116.1(C-6),34.9(C-7),31.8(C-8～C-10),34.4(C-11),29.8(C-12～C-14)。以上數據與文獻[24]報道基本一致,故鑒定化合物14為2,4-二叔丁基苯酚。

化合物15無色針晶(甲醇);mp.108～110 ℃;ESI-MS:m/z393[M-H]-,分子式為C28H42O;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.54(2H,d,J= 8.4 Hz,H-6,H-6′),7.36(2H,d,J= 2.3 Hz,H-3,H-3′),7.13(2H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-5,H-5′),1.33(18H,s,H-8～H-10,H-8′～H-10′),1.28(18H,s,H-12～H-14,H-12′～H-14′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:147.2(C-1,C-1′),147.8(C-2′),147.7(C-2),124.6(C-3,C-3′),138.5(C-4),138.6(C-4′),124.1(C-5,C-5′),119.2(C-6),119.2(C-6′),35.2(C-7,C-7′),31.6(C-8～C-10,C-8′～C-10′),34.7(C-11,C-11′),30.3(C-12～C-14,C-12′～C-14′)。以上數據與文獻[25]報道基本一致,故鑒定化合物15為2,2′-oxybis(1,4-di-tert-butylbenzene)。

化合物1～15結構見圖1。

圖1 化合物1～15的化學結構

2.2 化合物的抗炎活性篩選結果

2.2.1 對細胞活力的影響

MTT法測定15個化合物對RAW 264.7細胞毒性發(fā)現,與對照組(control group,CON)相比,各單體化合物在濃度50 μmol/L時,均未發(fā)現明顯的細胞毒性,故可選濃度為50 μmol/L進行抗炎活性篩選(見圖2)。

圖2 不同濃度的化合物1～15對RAW 264.7細胞活力的影響

2.2.2 對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放的NO影響

體外抗炎活性篩選結果表明,與CON相比,模型組(LPS)釋放NO顯著增加(P< 0.01)。與模型組相比,化合物1、5、9和DXMS能顯著抑制LPS誘導RAW 264.7釋放NO量(P< 0.01),其半數抑制濃度IC50分別為26.23±4.67、25.20±1.30、20.86±3.57和10.16±4.37 μmol/L,化合物4、6和10對LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放的NO具有抑制作用,其余化合物對釋放NO抑制作用不明顯(見圖3、表1)。

表1 化合物1～15對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的抑制活性

圖3 不同濃度的化合物1～15對LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO的影響

3 結論

通過對五嶺龍膽進行提取分離,共得到15個化合物,包括6個三萜類、1個苯丙素、3個甾醇類及5個其他類化合物,其中7、14和15為首次從龍膽屬植物中分離得到,其余化合物為首次從五嶺龍膽中分離得到。三萜類化合物為龍膽屬植物的重要組成成分,以五環(huán)三萜的齊墩果烷型和烏蘇烷型最常見,具有抗炎、抗菌、免疫調節(jié)及保肝等作用[8,26-29],為龍膽屬植物的藥效物質。通過抗炎活性篩選發(fā)現,五嶺龍膽中分離得到的齊墩果酸和熊果酸具有一定的抗炎活性,為五嶺龍膽抗炎活性的藥效物質。本論文分離的化合物主要來源于五嶺龍膽乙酸乙酯萃取部位,龍膽屬中環(huán)烯醚萜類和黃酮類成分主要為其苷類成分,如龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和木犀草素等成分,苷類成分極性較大,故推測五嶺龍膽環(huán)烯醚萜類和黃酮類成分存在于正丁醇萃取部位,后續(xù)將繼續(xù)相關研究。綜上,本研究豐富了五嶺龍膽化學成分和藥理活性研究,闡明了其發(fā)揮抗炎活性的物質基礎,為其進一步的研究開發(fā)提供參考依據。