三種百里香揮發(fā)油成分、抑菌活性和對人體肝癌細(xì)胞毒性研究

韓 峰,孫耀文,馬迎梅*,鄭麗娜,劉承昊,趙博揚(yáng)

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院;2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院;3內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司,呼和浩特 010000

百里香是唇形科(Lamiaceae)的一種小半灌木,廣泛分布于內(nèi)蒙古、黑龍江等地。百里香揮發(fā)油是百里香特有的揮發(fā)物質(zhì),它的含量因生長環(huán)境和種類會有差異,大多為萜烯類和芳香族類化合物,其中百里香酚和香芹酚的含量最高[1,2]。百里香揮發(fā)油因其有很好的抗氧化作用,所以在食品添加劑和美容護(hù)膚品中廣泛應(yīng)用,又因其對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和鼠傷寒沙門氏等致病菌具有很強(qiáng)的抑制作用[3],所以在醫(yī)藥領(lǐng)域也頗受關(guān)注,雖然有關(guān)植物揮發(fā)油誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制已有較多的文獻(xiàn)報道,但是對于百里香屬植物揮發(fā)油的研究報道較少,對其如何導(dǎo)致癌細(xì)胞壞死和凋亡的研究鮮有報道,也缺乏系統(tǒng)研究。

本研究以檸檬百里香(Thymuscitriodorus)、百里香(Thymusmongolicus)、法國百里香(Thymusvulgaris)為材料,采用水蒸氣蒸餾法提取三種百里香揮發(fā)油,結(jié)合氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析其化學(xué)成分,研究其抑菌作用和對肝癌細(xì)胞毒性的影響,為進(jìn)一步綜合開發(fā)百里香揮發(fā)油提供更多的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

百里香采集于內(nèi)蒙古大青山,檸檬百里香和法國百里香購于山東新泰市綠色農(nóng)業(yè)科技園,經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)李紅老師鑒定確認(rèn),并將其置于室內(nèi)陰涼處,待自然陰干后粉碎過80目篩;鐮刀菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物教研室提供,保存于-80 ℃冰箱;所用試劑均為分析純,購于無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 百里香精油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取百里香揮發(fā)油[4]。百里香整株通風(fēng)陰干,粉碎保存待用。取百里香粉末20 g,置于1 000 mL圓底燒瓶中,加蒸餾水600 mL混勻,室溫下浸泡1 h。之后將圓底燒瓶,置于可調(diào)式電熱套中,加熱至沸騰,進(jìn)行蒸餾1 h。將收集到的混合物倒入分液漏斗中靜置,待油水分離,從分液漏斗下部放出冷凝水,獲得百里香精油。

1.3 百里香精油GC-MS分析

色譜條件:色譜為HP-5MS,5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度為250 ℃,程序為初始溫度50 ℃(5 min),以8 ℃/min升溫速率至150 ℃(保持10 min),10 ℃升至250 ℃(保持8 min),載氣為高純氦氣,柱前壓20 kPa,流速1 mL/min,分流比37∶1。

質(zhì)譜條件:接口溫度為280 ℃,電離方式為EⅠ,電子能量為70 eV,離子源溫度250 ℃,四極桿溫度130 ℃,調(diào)諧方式為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧,質(zhì)量掃描方式為SCAN,溶劑延遲為3 min,掃描范圍為35～550 amu。

1.4 菌懸液制備

將鐮刀菌接種于營養(yǎng)肉湯中,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,將對數(shù)生長期的菌種接種于PDA固體培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)24 h。將菌體配制成濃度為1×106～1×107CFU/mL的菌懸液,備用[5]。

1.5 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

利用二倍稀釋法和打孔法測定百里香精油的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[6]。用二倍稀釋法分別配制不同濃度的精油溶液,百里香揮發(fā)油用吐溫-80溶液稀釋,吸取100 μL菌液均勻涂布到無菌平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后,以5 mm打孔器對菌平板進(jìn)行打孔,分別加入100 μL百里香揮發(fā)油、鏈霉素、蒸餾水作為藥物組、陽性組、陰性對照組。在恒溫箱中培養(yǎng),利用十字交叉法測定抑菌圈直徑,每組試驗做3個重復(fù),最終結(jié)果取3次試驗平均值。向96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入適量菌液,加入百里香精油,將培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,以最后一個不顯示濁度,細(xì)菌無生長的藥液稀釋度作為MIC。吸取該濃度混合液20 μL,再涂布于平板,置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,若平板仍然完全沒有菌株生長,則該濃度即為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。

1.6 人體肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存人體肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后,在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),之后每天觀察細(xì)胞生長狀況,待其單層生長至鋪滿細(xì)胞瓶底部,記錄其生長天數(shù)。

1.7 CCK-8法檢測

選用對數(shù)生長期的貼壁肝癌細(xì)胞,用胰酶消化后,用含10%小牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基配成5 000個/mL的細(xì)胞懸液,接種在96孔培養(yǎng)板中,每孔接種200 μL,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)。棄液后,用PBS清洗2遍。在試驗組分別加入100 μL不同濃度的精油溶液,陰性對照組和無細(xì)胞組加入等體積的DMSO,藥物培養(yǎng)基組加入含有1 μg/mL精油的DMSO。將加百里香精油后的96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)時間要大于細(xì)胞傳代時間。棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL含有10%的CCK-8培養(yǎng)液,顯色相應(yīng)時間后,用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度,所有實驗重復(fù)3次,以Bliss法計算揮發(fā)油對人體肝癌細(xì)胞的IC50值[7,8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種百里香葉揮發(fā)油成分比較

檸檬百里香、百里香和法國百里香揮發(fā)油的總離子流圖(total ions chromatogram,TIC)見圖1～3。

圖1 檸檬百里香葉揮發(fā)油總離子流圖

圖2 百里香揮發(fā)油總離子流圖

圖3 法國百里香葉揮發(fā)油總離子流圖

以面積歸一化法確定三種百里香揮發(fā)油中各成分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù),并結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行成分鑒定,從揮發(fā)油中鑒定出50個匹配度大于等于90%的成分(見表1)。由表1可以看出,3種百里香揮發(fā)油的主要成分和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定差異,共鑒定出50種化合物[9]。其中,檸檬百里香中酚類化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多(37.88%),其次為醇類(27.57%)和醛類(13.56%),萜烯類和酮類化合物組分少,不含醚類化合物;此外,檸檬醛和異檸檬醛僅存在于檸檬百里香揮發(fā)油中,二者相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和為13.56%。百里香揮發(fā)油共鑒定出29種化合物,占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的92.91%,其中酚類化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.05%、萜烯類為21.92%、醇類為14.77%;主要成分為百里香酚(30.48%)、異百里香甲醚(12.45%)、芳樟醇(5.21%)等;法國百里香揮發(fā)油共鑒定出30種化合物,占總含量的90.01%;其中酚類化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.93%、萜烯類為22.11%、醇類為14.96%,主要成分為百里香酚(32.17%)、異百里香甲醚(9.78%)、芳樟醇(4.17%)、石竹素(3.70%)等。

表1 三種百里香揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 三種百里香揮發(fā)油的抑菌作用

通過不同濃度的百里香揮發(fā)油處理三種不同的菌株,獲得最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)結(jié)果見表2。從表中可以看出,百里香屬植物揮發(fā)油普遍都有很好的抑菌作用,其中檸檬百里香揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和燕麥鐮刀菌的抑菌活性最強(qiáng),且比陽性對照鏈霉素的效果好,其MIC值分別是366.4、549.6和732.8 μg/mL,法國百里香揮發(fā)油抑制作用最弱,百里香揮發(fā)油的抑菌效果,則介于以上兩種揮發(fā)油之間[10]。同時,三種揮發(fā)油對不同菌株均表現(xiàn)出很好的殺菌活性[11],檸檬百里香揮發(fā)油對于真菌(燕麥鐮刀菌)的殺菌作用強(qiáng)于陽性對照,其他兩種揮發(fā)油都弱于陽性對照組。

表2 三種百里香揮發(fā)油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.3 三種百里香揮發(fā)油對人體肝癌細(xì)胞毒性作用

三種百里香揮發(fā)油對肝癌HepG2細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性作用(見圖4),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性[12],在所用劑量下作用HepG2細(xì)胞48 h,檸檬百里香揮發(fā)油的IC50值為18.32 μg/mL、百里香為45.75 μg/mL、法國百里香為73.36 μg/mL。由圖5可知,隨著濃度增加三種百里香揮發(fā)油對HepG2細(xì)胞的抑制率逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)出明顯的差異性,檸檬百里香的抑制率最強(qiáng),法國百里香最弱。

圖4 三種百里香揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞HepG2的劑量—反應(yīng)關(guān)系

圖5 不同濃度下三種百里香揮發(fā)油對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率

3 討論與結(jié)論

從芳香植物中提取獲得植物揮發(fā)油,因?qū)θ梭w相對安全,毒性低、易降解和綠色環(huán)保的特征,被作為化學(xué)殺菌劑的有效替代品和抑癌劑。不同的藥用植物,其揮發(fā)油的組成成分均不相同,一般來說主要含各種萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物和含氮含硫化合物等。目前,針對百里香揮發(fā)油有效成分在抗腫瘤方面的研究較少,本研究采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法獲得三種百里香揮發(fā)油,通過GC-MS分析其成分上的差異,其中最為明顯的是檸檬百里香揮發(fā)油中有檸檬醛和異檸檬醛兩種化合物,而另外兩種揮發(fā)油中則沒有這兩種物質(zhì)[13,14],試驗利用三種百里香揮發(fā)油處理不同的植物病原菌,發(fā)現(xiàn)它們在抑菌方面表現(xiàn)出不同的能力,其中檸檬百里香揮發(fā)油的抑菌效果最好,尤其對大腸桿菌的抑制作用最為明顯。相比之下,法國百里香揮發(fā)油的抑菌能力較弱,百里香揮發(fā)油次之。試驗還通過CCK-8法分析其對肝癌細(xì)胞系增殖和凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種百里香揮發(fā)油能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡,在抗腫瘤藥物開發(fā)方面具有一定的研究潛力。這種抑菌和抗癌功能與百里香屬揮發(fā)油的組成成分密切相關(guān),其中含量最多的百里香酚不僅對植物真菌、皮膚癬菌和人體炎癥療效顯著,還顯示出了良好的抗腫瘤藥理活性,例如,百里香酚可從絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和凋亡基因Bax等方面誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞凋亡,并通過降低線粒體跨膜誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS,增強(qiáng)Caspase的表達(dá)和下調(diào)Bcl-2的表達(dá),來增加MAPK和ERK磷酸化等途徑發(fā)揮抗癌作用[15]。此外,還有檸檬醛可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),提高細(xì)胞內(nèi)丙二醛水平降低還原型谷胱甘肽,誘導(dǎo)引起白血病細(xì)胞凋亡,還可以通過上調(diào)促凋亡蛋白BAK表達(dá)和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)來抑制淋巴瘤細(xì)胞的增殖,阻滯細(xì)胞周期抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[16]。Zhao等[17]用薰衣草精油對人肝癌細(xì)胞HepG2的生長抑制作用,結(jié)果顯示薰衣草精油能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖,并呈濃度依賴性,處理后,不同質(zhì)量濃度的薰衣草精油作用HepG2后出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞群及壞死細(xì)胞。Jia等[18]發(fā)現(xiàn)檸檬烯可以提高Bax和細(xì)胞色素的含量,降低Bcl-2的表達(dá),誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T凋亡;Jaganathan等[19]證實酚能通過活化p53和Caspase-3,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

天然植物揮發(fā)油是一個極具潛力的生物資源,隨著對百里香屬植物揮發(fā)油研究的深入,將會為臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥護(hù)理和食品安全方面提供更多的可能性,為研制新的天然抗氧化劑和抗腫瘤藥物開辟新途徑。