錦燈籠UPLC-Q-Orbitrap HRMS指紋圖譜及抗菌活性的譜效關(guān)系

張傳洋,楊璐嘉,陳翠平,王 輝,趙元靜,鄧 放

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都 611137

錦燈籠,又名酸漿、紅姑娘,為茄科酸漿屬植物酸漿PhysalisalkekengiL.var.franchetii(Mast.) Makino的干燥宿萼或帶果實的宿萼。味酸苦,性寒,歸肺脾二經(jīng)。具有清熱解毒、利咽化痰、利尿通淋之功效,臨床用于治療咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小便淋漓[1]。錦燈籠化學(xué)成分多樣,主要包括酸漿苦素、黃酮、蔗糖酯、苯丙素、生物堿等類成分[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,錦燈籠醇提取物及二氯甲烷提取物對于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及念珠桿菌均有較好的抑制活性[3],部分酸漿苦素成分也被證實具有顯著的抑菌作用[4]。目前國內(nèi)外對于錦燈籠抗菌活性的研究較多,然而其物質(zhì)基礎(chǔ)尚不十分明確。

中藥本身成分復(fù)雜多樣,在發(fā)揮藥效時具有多靶點、整體調(diào)節(jié)等特點。中藥譜效關(guān)系是建立在中藥指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上,將指紋圖譜和藥效作用聯(lián)系起來,開展譜-效關(guān)系的研究,進一步明確發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[5,6]。目前,有關(guān)錦燈籠的指紋圖譜研究及其譜效關(guān)系研究較少。因此,本研究擬從錦燈籠的譜效關(guān)系去挖掘其抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過建立三個不同產(chǎn)地共計16批次錦燈籠的質(zhì)譜指紋圖譜,并測定其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性,通過灰色關(guān)聯(lián)分析,探討特征峰與其抑菌活性的相關(guān)性,以闡明其抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ),旨在為錦燈籠的進一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

錦燈籠藥材16批,其中安徽產(chǎn)地6批(S1～S6),購于安徽亳州藥材市場;吉林產(chǎn)地4批(S7～S10),購于吉林長白山土特產(chǎn)商行;河北產(chǎn)地6批(S11～S16),購于河北安國藥材市場。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龍飛副教授鑒定為酸漿PhysalisalkekengiL.var.franchetii(Mast.) Makino的干燥宿萼。所購買的宿萼均為橙紅色,且無蟲蛀和霉變。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC25 923)和大腸埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922)均購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.3 儀器

Vanquish超高效液相色譜聯(lián)用Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);KQ3200E型超聲波清洗器(頻率40 kHz,功率650 W,昆山市超聲儀器有限公司);PYX-DHS.500-BY型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司);SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);DEN-1型麥?zhǔn)想娮颖葷醿x(英國Grant儀器有限公司);Discovery DV215CD十萬分之一天平(美國Ohaus儀器有限公司);BS124S萬分之一分析天平(德國Sartorius科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.4 對照品與試劑

對照品綠原酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素(批號分別為DSTDL002101、DSTDL001701、DST201102-016、DST200910-032,純度均大于98%,成都德思特生物技術(shù)有限公司);M-H(A)固體培養(yǎng)基(英國Oxoid公司);LB固體培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司);色譜純乙腈和甲酸(美國Fisher公司);甲醇、二甲亞砜(DMSO)(成都市科龍化工試劑廠);水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS樣品及條件

1.2.1.1 溶液的制備

對照品溶液的制備:分別精密稱取各對照品綠原酸、蘆丁、木犀草苷、木犀草素適量,加甲醇溶解,制成含上述各成分濃度均為0.05mg/mL的混合對照品溶液,即得。

供試品溶液的制備:精密稱取錦燈籠粉末(過2號篩)約1 g,置50 mL錐形瓶中,精密加入70%甲醇-水25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(40 kHz,150 W)處理30 min,再次稱定質(zhì)量,用70%甲醇-水補足堿失的重量,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

1.2.1.2 UPLC-Q-Orbitrap HRMS條件

色譜條件:Thermo Scientific AccucoreTMC18色譜柱(3 mm × 100 mm,2.6 μm),流動相為0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min,5%→20%B;10～25min,20%→25%B;25～50 min,25%→60%B;50～70 min,60%→90%B;70～75 min,90%→95%B),流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為4 μL。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI),掃描模式為Full MS/dd-MS2下負離子進行掃描檢測。噴霧電壓3.0 kV,輔助氣加熱溫度350 ℃,鞘氣流速35 arb,輔助氣流速10 arb,離子傳輸管溫度320 ℃。一級分辨率35 000,二級分辨率17 500,掃描范圍m/z100～1 500,碰撞能量梯度為20、40、60 eV,Top N = 5。

1.2.2 抑菌活性

1.2.2.1 菌懸液的制備

將在4 ℃保存的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株劃線接種于無菌LB瓊脂培養(yǎng)基表面,在37 ℃孵箱中孵育24 h。取生長良好的菌團混懸于生理鹽水中并校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?備用。

1.2.2.2 供試品溶液制備

通過預(yù)實驗,發(fā)現(xiàn)錦燈籠在質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時抑菌活性良好。因此將供試品溶液進行濃縮,再用DMSO溶液進行溶解,使質(zhì)量濃度達到0.05 g/mL,以DMSO溶液為空白對照,在超凈工作臺上經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即為抑菌樣品液。

1.2.2.3 抑菌活性測定

將備用的細菌混懸液均勻涂抹于無菌MH-A平板表面。將牛津管分別置于4個涂板完成的MH-A平板上,順時針依次向各個牛津管中加入S1～S16號樣品。將培養(yǎng)基放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 錦燈籠指紋圖譜的研究

2.1.1 精密度試驗

取同一供試品溶液(S1)按“1.2.1.2”項下條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。選擇20號峰為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),分別為<0.2%和<4.5%,表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(S1),分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“1.2.1.2”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。以20號峰為參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD,分別為<1.2%和<4.7%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性試驗

取樣品S1粉末適量,精密稱定6份,按“1.2.1.1”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.1.2”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。以20號峰為參照峰,計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD,分別為<0.3%和<5.1%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 錦燈籠指紋圖譜的建立及相似度評價

利用Xcalibur軟件對16批錦燈籠的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理,提取并積分總離子流圖,導(dǎo)出色譜峰峰面積、峰高和保留時間等信息,建立相似度評價軟件可識別的.txt格式數(shù)據(jù)文件,再導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)。選擇樣品S1的譜圖作為參照譜圖,時間窗寬度設(shè)為0.1 min,選取多個特征峰進行多點校正,自動峰匹配,共標(biāo)定了38個共有峰。分別生成16批錦燈籠的UPLC-Q-Orbitrap HRMS指紋圖譜和對照指紋圖譜(見圖1和2)。

圖1 16批錦燈籠的指紋圖譜

圖2 錦燈籠的對照指紋圖譜

16批錦燈籠藥材色譜圖和對照譜圖進行相似度評價,S1～S16相似度均大于0.95,表明16批次錦燈籠的相似度較好,結(jié)果見表1。

表1 錦燈籠樣品指紋圖譜相似度評價

2.1.5 共有峰的指認(rèn)

將采集得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.2質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件中,建立未知化合物鑒定的工作流程,設(shè)置一級及二級質(zhì)量偏差<5 ppm,進行峰提取、峰對齊等。根據(jù)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)和精確的二級碎片離子信息,結(jié)合前期對錦燈籠化學(xué)成分的分析結(jié)果[7],以及參照相關(guān)文獻[8,9]及與對照品比對,對共有峰進行鑒定和歸屬。分析結(jié)果表明,38個共有峰中有22個峰為蔗糖脂肪酸酯類(sucrose fatty acid ester,SFAE)成分,由于其同分異構(gòu)體眾多,通過質(zhì)譜分析并不能得到其準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu),另外從16個共有峰中共鑒定出9個成分,結(jié)果見表2。

2.1.6 聚類熱圖分析

將16批錦燈籠指紋圖譜的38個共有峰的峰面積導(dǎo)入分析網(wǎng)站(https://hiplot-academic.com/)做聚類熱圖分析,結(jié)果見圖3。聚類分析將這16批錦燈籠分為了兩大類:安徽產(chǎn)地聚為一類,吉林和河北產(chǎn)地聚為一類,這可能是和藥材產(chǎn)地地理位置的遠近相關(guān)。另外,在第二大類中吉林和河北產(chǎn)地的藥材分別各自聚為一類,進一步說明產(chǎn)地對于藥材的影響。

圖3 16批錦燈籠的聚類熱圖

2.1.7 主成分分析

將16批錦燈籠指紋圖譜的38個共有峰的峰面積組成38×16階矩陣,導(dǎo)入到SIMCA14.1軟件進行主成分分析(PCA分析)。模型提取的4個主成分累積方差貢獻率R2X達到0.842(顯著大于0.5),預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.544(大于0.5),表明提取的主成分可以解釋84.2% 的原始變量,模型預(yù)測能力為54.4%,模型擬合程度和穩(wěn)定性較好。從得分散點圖可知(見圖4),PCA-X模型中所有數(shù)據(jù)點均在95%置信區(qū)間內(nèi),聚類良好,區(qū)分明顯,可分為三類,說明不同產(chǎn)地的錦燈籠樣品在化學(xué)成分及含量上存在一定差異,同一產(chǎn)地的樣品相似度高,具有趨勢性。

圖4 16批錦燈籠的主成分得分圖

2.2 錦燈籠抑菌活性

如表3所示,不同批次的錦燈籠提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有較好的抑制活性,其中金黃色葡萄球菌的抑菌圈范圍為0.9～1.2 cm,大腸桿菌的抑菌圈范圍為1.3～1.9 cm,由此可見,錦燈籠對大腸桿菌的抑制活性優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

表3 16批次錦燈籠藥材抑菌圈直徑

2.3 錦燈籠譜效關(guān)系研究

通過灰色關(guān)聯(lián)分析16批次錦燈籠的化學(xué)成分與抑菌活性之間的譜效關(guān)系。以錦燈籠指紋圖譜中38個共有峰為參考序列,以錦燈籠藥材對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑大小作為比較序列,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理網(wǎng)站(https://www.spsspro.com/)進行灰色關(guān)聯(lián)度分析。將數(shù)據(jù)統(tǒng)一進行無量綱化處理,采用均值化處理法計算關(guān)聯(lián)度系數(shù),結(jié)果見表4和5。

表4 16批次錦燈籠共有峰與抗金黃色葡萄球菌活性的關(guān)聯(lián)度

表5 16批次錦燈籠共有峰與抗大腸桿菌活性的關(guān)聯(lián)度

通過分析結(jié)果可知,峰27對于抑制金黃色葡萄球菌的生長具有較大貢獻(關(guān)聯(lián)度≥0.85);峰37、29、30、19、33、35、31、17、32、20和28(關(guān)聯(lián)度≥0.85)對大腸桿菌的抑菌活性具有較大貢獻。值得注意的是,這些化合物均為蔗糖脂肪酸酯類成分。

3 討論與結(jié)論

本實驗前期考察了不同濃度甲醇(50%、70%、100%)對錦燈籠藥材提取效果的影響,發(fā)現(xiàn)70%甲醇-水提取時出峰最多。同時,在進行質(zhì)譜條件的考察時發(fā)現(xiàn),負離子模式下的總離子流圖更加穩(wěn)定,峰形也更加好看,故選擇在負離子掃描模式下進行實驗。

本研究建立了16批錦燈籠藥材指紋圖譜,提取出了38個共有峰,相似度均在0.95以上,說明不同產(chǎn)地的錦燈籠藥材質(zhì)量相對比較穩(wěn)定;聚類分析和PCA分析結(jié)果均可將樣品按照不同產(chǎn)地進行聚類,說明藥材的生長環(huán)境是造成質(zhì)量差異的較大因素。

同時,本研究測定了16批錦燈籠提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性,首次將指紋圖譜和藥效結(jié)果相結(jié)合,采用灰色關(guān)聯(lián)分析研究錦燈籠的譜效關(guān)系。結(jié)果顯示,錦燈籠的抑菌活性可能是多成分共同作用的結(jié)果。其中,對抗菌活性貢獻較大(關(guān)聯(lián)度≥0.85)的特征峰均為蔗糖脂肪酸酯類成分,說明該類成分對于錦燈籠發(fā)揮抗菌活性具有較大的貢獻。

以往,學(xué)者對于錦燈籠的研究大多集中于化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性顯著的酸漿苦素類成分,而忽視了對蔗糖脂肪酸酯的研究。蔗糖脂肪酸酯類成分其結(jié)構(gòu)特征是以蔗糖為母核,通過酯鍵連有一個或多個脂肪酸鏈片段?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,該類化合物具有顯著的抗菌[10]、抗炎[11]、降血糖[12]、抗腫瘤[13]、殺蟲[14]等活性。同時,蔗糖脂肪酸酯具有良好的生物降解性能和毒理學(xué)性質(zhì)[15-16],因此該類成分的應(yīng)用前景廣闊,值得我們重視。

綜上,本研究成功建立了錦燈籠提取物的指紋譜圖,并首次對其譜效關(guān)系進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖脂肪酸酯類成分與錦燈籠的抗菌活性相關(guān)性極大。然而,由于其結(jié)構(gòu)的特殊性,在本次實驗中未能通過質(zhì)譜手段對其結(jié)構(gòu)進行深入解析。后續(xù),將對錦燈籠中的該類成分進行分離純化,對其抗菌活性進行驗證,并在此基礎(chǔ)上總結(jié)其構(gòu)效關(guān)系,為進一步研究錦燈籠的抗菌活性及其作用機制提供參考。