紅芪顏色與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的相關(guān)性研究

王 燕,強(qiáng)正澤,李成義,賈妙婷,魏小成,王明偉,李 碩

甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000

紅芪(Hedysari Radix)為甘肅道地藥材和特產(chǎn)藥材,是甘肅南部地區(qū)振興鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一,甘肅武都區(qū)已成為“中國(guó)紅芪之鄉(xiāng)”,所產(chǎn)紅芪藥材已形成“米倉(cāng)紅芪”品牌。課題組實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),紅芪呈現(xiàn)出棕黃色、紅棕色、紅褐色、黃棕色等多樣化的顏色特征。

顏色不僅是中藥辨色論質(zhì)理論的重要組成部分[1],而且“顏色”作為中藥最直觀的特征,與其內(nèi)在質(zhì)量有著緊密聯(lián)系。漢代以前人們便開(kāi)始重視藥物顏色[2,3],如《神農(nóng)本草經(jīng)》中以青、赤、黃、白、黑等顏色命名的藥物有68種,《本草經(jīng)集注》[4]記載樸硝“色青白者佳,黃者傷人,赤者殺人”;《新修本草》[5]記載秦皮“取皮水漬,便碧色,書(shū)紙看背,青色者是”;《本草原始》[6]記載白術(shù)“惟白為勝”、黃連“黃色鮮明者為勝”、丹參“根皮丹而肉紫者佳”、木香“肉色青者優(yōu),黃白者次之,色黑油者下”;《本草綱目》[7]中還記載了藥材顏色與產(chǎn)地的關(guān)系,如黃芩“西芩……色黔,北芩……深黃”,說(shuō)明顏色與中藥的名稱(chēng)、功效、藥物鑒定、品質(zhì)、產(chǎn)地等方面存在密切關(guān)系。不僅如此,現(xiàn)代研究表明,中藥顏色與其藥性、化學(xué)成分密切相關(guān)[8-9],是藥材“外部?jī)?yōu)形”與“內(nèi)部?jī)?yōu)質(zhì)”互為統(tǒng)一的橋梁[10],利用顏色可對(duì)藥材的產(chǎn)地、品種[11]、采收期[12]、貯藏[13,14]、炮制工藝[15]等進(jìn)行判別和評(píng)價(jià)。同時(shí),顏色可作為藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16],《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)2020年版[17]中200余種藥材亦將“顏色”作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。高等植物的葉、花、果及根因富含類(lèi)胡蘿卜素,其結(jié)構(gòu)為四萜烯色素,呈現(xiàn)出黃色、橙紅色、紅色和紫色,與植物的顏色形成具有密切關(guān)系,同時(shí)具備抗氧化、光保護(hù)、著色、增強(qiáng)免疫力、防癌抗癌等功能與生理活性,已被廣泛應(yīng)用于食品、保健、護(hù)膚與化妝、醫(yī)藥、飼養(yǎng)等行業(yè)[18-21]。

基于此,課題組以紅芪為研究對(duì)象,采用精密色差儀及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)開(kāi)展紅芪顏色與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的相關(guān)性研究,分析顏色與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,解析不同顏色紅芪樣品中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的差異性規(guī)律,以期為紅芪顏色多樣性產(chǎn)生的原因及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

2021年10月收集12份不同顏色紅芪樣品,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的根,標(biāo)本(編號(hào):Y-2021-AH-01)現(xiàn)保存于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)實(shí)驗(yàn)室。后經(jīng)過(guò)除雜、搓條加工、干燥等產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)制成實(shí)驗(yàn)樣品,以“肉眼”主觀判斷按照顏色分為4組,其中HC1為棕黃色、HC2為紅棕色、HC3為紅褐色、HC4為黃棕色。樣品信息見(jiàn)表1,不同顏色紅芪樣品見(jiàn)圖1。

圖1 不同顏色紅芪樣品

表1 不同顏色紅芪樣品信息

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS(QTRAP 6500+,SCIEX);離心機(jī)(5424R,Eppendorf);電子天平(AS 60/220.R2,RADWAG);球磨儀(MM400,Retsch);離心濃縮儀(CentriVap,LABCONCO);多管渦旋振蕩器(MIX-200,上海凈信);超聲清洗儀(KQ5200E,昆山舒美);高速中藥粉碎機(jī)(ZN-04A,北京興時(shí)利);精密色差儀(NR110,深圳三恩時(shí))。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈、乙醇(色譜純,Merck);丙酮(色譜純,國(guó)藥);甲酸(色譜純,Sigma-Aldrich);氯化鈉(分析純,羅恩);氫氧化鉀(分析純,滬試);甲基叔丁基醚、正己烷(色譜純,安譜實(shí)驗(yàn)CNW);2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)(色譜純,Aladdin);標(biāo)準(zhǔn)品:α-胡蘿卜素(BOC Sciences,7488-99-5-10 mg,純度95%);番茄紅素(羅恩,R007285-100 mg,純度98%);γ-胡蘿卜素(Sigma,54765-1 mg,純度≥90%);β-胡蘿卜素(羅恩,RO19713,純度96%);六氫番茄紅素(BOC Sciences,27664-65-9-1 mg,純度95%);α-隱黃質(zhì)(BOC Sciences,24480-38-4-1 mg,純度>98%);海膽烯酮(BOC Sciences,432-68-8-1 mg,純度98%);β-檸烏素(BOC Sciences,650-69-1-1 mg,純度95%);八氫番茄紅素(BOC Sciences,13920-14-4-250 μg,純度> 95%);ε-胡蘿卜素(ZCN,ZCN-0020,純度95%);玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯(zzstandard,ZCN-0126-1 mg,純度95%);花藥黃質(zhì)(ZCN,ZCN-0231,純度95%);玉米黃質(zhì)(畢得,BD2134-5 mg,純度98%);紫黃質(zhì)(sigma,52444-1 mg,純度≥90%);新黃質(zhì)(BOC Sciences,14660-91-4-1 mg,純度≥99%);葉黃素(阿拉丁,X109574-10 mg,純度90%);β-隱黃質(zhì)(ExtraSynthese,ZES-0317S-1 mg,純度≥95%);蝦青素(羅恩,R004353-25 mg,純度96%);8′-β-阿樸胡蘿卜素醛(阿拉丁,A106806,純度96%);辣椒紅素(ExtraSynthese,ZES-0312S-5 mg,純度≥95%);辣椒玉紅素(BOC Sciences,470-38-2-1 mg,純度≥90%);角黃素(BOC Sciences,514-78-3-5 mg,純度95%)。

2 方法

2.1 紅芪藥材顏色值測(cè)定

2.1.1 供試品的制備方法

取紅芪樣品,粉碎,過(guò)4號(hào)篩。將粉末置于粉末測(cè)試盒中,以測(cè)試盒中粉末不隨意晃動(dòng)為準(zhǔn),蓋上石英鏡片,備用。

2.1.2 樣品測(cè)量方法

按上述制備方法制備供試品后,采用精密色差儀(測(cè)量條件:照明光源:D65;觀察者角度:10度視角;測(cè)量口徑Φ:4 mm),連續(xù)測(cè)量6次,每份樣品重復(fù)3次,記錄L*、a*、b*、C*、h°等顏色值(注:①L*表示顏色亮度,即當(dāng)L*=0時(shí),為黑色;當(dāng)L*=100時(shí),為白色;②a*表示紅綠色軸,即當(dāng)a*<0時(shí),為綠色;當(dāng)a*>0時(shí),為紅色;③b*表示黃藍(lán)色軸,即當(dāng)b*<0時(shí),為藍(lán)色;當(dāng)b*>0時(shí),為黃色;④C*表示飽和度值;⑤h°表示色調(diào)角度值)。

2.1.3 重復(fù)性考察

2.1.4 精密度考察

2.2 紅芪藥材類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的測(cè)定

2.2.1 檢測(cè)的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分信息

紅芪藥材中共檢測(cè)類(lèi)胡蘿卜類(lèi)成分68種,信息見(jiàn)表2。

表2 68種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)化合物信息

2.2.2 樣品前處理

紅芪藥材樣品真空冷凍干燥后用球磨儀研磨(30 Hz,1 min)至粉末狀,稱(chēng)取50 mg研磨后的樣本,用0.5 mL含0.01% BHT(g/mL)的正己烷/丙酮/乙醇混合溶液(1∶1∶1,V/V/V)進(jìn)行提取,室溫下渦旋20 min后,4 ℃條件下,12 000 r/min,離心5 min,取上清液,重復(fù)提取一次后離心合并上清液,將得到的提取液濃縮后,用100 μL甲醇/甲基叔丁基醚混合溶液(1∶1,V/V)復(fù)溶,過(guò)0.22 μm濾膜后,保存于棕色進(jìn)樣瓶中,用于LC-MS/MS分析。

2.2.3 色譜質(zhì)譜采集條件

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)(ExionLCTMAD,https://sciex.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)(QTRAP?6 500+,https://sciex.com.cn/)。液相條件主要包括:色譜柱:YMC C30(3 μm,100 mm×2.0 mm i.d.);流動(dòng)相:A相,甲醇/乙腈(1∶3,V/V)加入0.01% BHT和0.1%甲酸;B相,甲基叔丁基醚加入0.01% BHT;梯度洗脫程序:0 min A/B為100∶0(V/V),3 min為100∶0(V/V),5 min為30∶70(V/V),9 min為5∶95(V/V),10 min為100∶0(V/V),11 min為100∶0(V/V);流速0.8 mL/min;柱溫28 ℃;進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件主要包括:大氣壓化學(xué)離子源(atmospheric pressure chemical ionization source,APCI)溫度350 ℃,氣簾氣(curtain gas,CUR)25 psi。在Q-Trap 6 500+中,每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)。

2.2.4 類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分含量測(cè)定數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用Analyst 1.6.3軟件分析處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),得到總離子流圖(A)和提取離子流圖(B)(見(jiàn)圖2),其橫坐標(biāo)為檢測(cè)的保留時(shí)間(min),縱坐標(biāo)為離子檢測(cè)的離子流強(qiáng)度(cps)。采用MultiQuant 3.0.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),參考標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與峰型信息,對(duì)待測(cè)物在不同樣本中檢測(cè)到的色譜峰進(jìn)行積分校正,以確保定性定量的準(zhǔn)確。

圖2 紅芪樣品的總離子流色譜圖(A)和提取離子流色譜圖(B)

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取Car_01～Car_07、Car_48、Car_55～Car_68,共22種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的標(biāo)準(zhǔn)品配制0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000、10.000、50.000、100.000、250.000、400.000 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)應(yīng)定量信號(hào)的色譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù);以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo),繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中Car_8～Car_47、Car_49～Car_54,共46種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分以新黃質(zhì)(Car_58)為對(duì)照,采用半定量法進(jìn)行測(cè)定。所檢測(cè)物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量下限(lower limit of quantification,LLOQ)、定量上限(upper limit of quantitation,ULOQ)見(jiàn)表3。

表3 類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的線性方程

2.2.6 樣品含量測(cè)定

按照“2.2.2”樣品前處理方法處理紅芪樣品,采用“2.2.3”色譜質(zhì)譜采集條件進(jìn)行進(jìn)樣,獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后,對(duì)所有目標(biāo)物的色譜峰進(jìn)行積分,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。將檢測(cè)到的所有紅芪藥材樣本的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及公式(1)計(jì)算紅芪樣品中該類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的含量。

(1)

式中:含量單位為μg/g,c表示樣本中積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的濃度值(μg/mL),V表示復(fù)溶時(shí)所用溶液的體積(μL);m表示稱(chēng)取的樣本質(zhì)量(g)。

2.2.7 樣本質(zhì)控分析

2.2.7.1 總離子流圖分析

為確保檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性,以混合溶液作為QC樣本,在儀器分析過(guò)程中,每隔10個(gè)檢測(cè)分析樣本插入一個(gè)質(zhì)控樣本,通過(guò)對(duì)同一質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)進(jìn)行重疊展示分析,可以判斷項(xiàng)目檢測(cè)期間儀器的穩(wěn)定性,儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要的保障。由圖3可知,代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高,即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致,表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測(cè)時(shí),信號(hào)穩(wěn)定性較好。

圖3 總離子流重疊圖

2.2.7.2 QC樣本的CV值分布圖分析

CV值即變異系數(shù)(coefficient of variation),是原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差與原始數(shù)據(jù)平均數(shù)的比,可反映數(shù)據(jù)離散程度。使用經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù)可以分析小于參考值的物質(zhì)CV出現(xiàn)的頻率,QC樣本的CV值較低的物質(zhì)占比越高,代表實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)越穩(wěn)定:QC樣本CV值小于0.3的物質(zhì)占比高于80%,表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定;QC樣本CV值小于0.2的物質(zhì)占比高于80%,表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常穩(wěn)定。由圖4可知,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定,圖中橫坐標(biāo)代表CV值,縱坐標(biāo)表示小于對(duì)應(yīng)CV值的物質(zhì)數(shù)目占總物質(zhì)數(shù)的比例,不同顏色代表不同的分組樣本,QC為質(zhì)控樣本,其中與X軸垂直的兩條參考線對(duì)應(yīng)的CV值為0.2和0.3,與X軸平行的參考線對(duì)應(yīng)物質(zhì)數(shù)目占總物質(zhì)數(shù)的80%。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以不同顏色4組12份紅芪樣品的色度值數(shù)據(jù),17種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分含量組成數(shù)據(jù)庫(kù)(未檢出的51種成分舍去,17種成分中部分成分在部分樣品未檢出的數(shù)據(jù)處理時(shí)用0代替),開(kāi)展單因素方差分析、PCA分析、聚類(lèi)分析、相關(guān)性分析、OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)與差異倍數(shù)值(fold change,FC)相結(jié)合的差異性類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物篩選,研究不同顏色紅芪的色度值及類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。

3 結(jié)果

3.1 不同顏色紅芪樣品的色度值分析

表4 紅芪樣品顏色值

表5 不同顏色紅芪樣品色度值的單因素方差分析

3.2 不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

按照“2.2.6”方法測(cè)定不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物含量,共計(jì)檢測(cè)68種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分(見(jiàn)表2),其中檢測(cè)出17種成分,包含2種胡蘿卜素與15種葉黃素類(lèi)成分。已檢出的物質(zhì)在不同顏色組別之間的含量差異見(jiàn)圖5、表6。由圖5、表6可知,4種顏色間17種類(lèi)胡蘿卜素成分含量間具有差異,Car_01、Car_17、Car_20三種成分在HC2紅棕色、HC3紅褐色樣品中均有檢出,且都在HC3紅褐色樣品中含量最高,其平均含量分別為0.036 9、0.016 3、0.010 8 μg/g,而在HC1棕黃色、HC4黃棕色樣品中未檢出;Car_04只在HC2紅棕色中檢出0.028 6 μg/g,在HC1棕黃色、HC3紅褐色、HC4黃棕色樣品中均未檢出;Car_15、Car_56、Car_67三種成分在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC3紅褐色中均有檢出,且Car_15在HC3中含量最高0.047 2 μg/g,Car_56、Car_67在HC2中含量最高,其平均含量分別為0.049 6、0.000 5 μg/g,而在HC4黃棕色樣品中未檢出;Car_16在HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均有檢出,且在HC2中含量最高0.010 7 μg/g,在HC1棕黃色、HC3紅褐色樣品中未檢出;Car_27、Car_51、Car_57、Car_59四種成分在HC1、HC2、HC3、HC4四種顏色樣品中均有檢出,其中Car_27、Car_51、Car_57三種成分在HC2紅棕色樣品中含量最高,其平均含量分別為0.055 7、0.008 2、0.339 2 μg/g,而Car_59在HC3紅褐色樣品中含量最高0.408 7 μg/g;Car_29在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均有檢出,且在HC2中含量最高0.293 7 μg/g,而在HC3紅褐色樣品中未檢出;Car_32、Car_33兩種成分只在HC3紅褐色樣品中檢出,其平均含量分別為0.026 1、0.043 4 μg/g,在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均未檢出;Car_55、Car_63兩種成分在HC1棕黃色、HC2紅棕色樣品中均有檢出,且Car_55在HC2中含量最高0.018 5 μg/g,Car_63在HC1中含量最高0.018 9 μg/g,而在HC3紅褐色、HC4黃棕色樣品中均未檢出,說(shuō)明17種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分在不同顏色紅芪樣品中的分布具有差異性。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步由單因素方差分析結(jié)果(見(jiàn)表7)可知,4種顏色樣品間Car_59、Car_56兩種成分具有顯著性差異(P<0.05),其他15種成分差異性未達(dá)顯著。

圖5 不同顏色組別中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分含量分布

表6 不同顏色紅芪樣品中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的含量

表7 不同顏色紅芪中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分單因素方差分析

3.3 不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的PCA分析

為分析不同顏色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的變化特征,采用SIMCA 14.1軟件中非監(jiān)督模式識(shí)別的主成分分析(principal component analysis,PCA)方法分析數(shù)據(jù)。不同顏色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素成分的PCA散點(diǎn)圖6(PC1 41.5%、PC2 23.1%)顯示,不同顏色的4組12份樣品均在95%的置信區(qū)間內(nèi),HC1(H1、H2、H3)棕黃色,HC2(H4、H5、H6紅棕色),HC3(H7、H8、H9為紅褐色)樣品分布較為分散,HC4(H10、H11、H12)黃棕色分布較為緊密,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),H10、H11、H12、H2、H3分布較為接近,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分信息量較為相似,H4、H8、H9分布較為接近,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分信息量較為相似,H1、H5分布較為接近,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分信息量較為相似,H6、H7分布較為接近,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分信息量較為相似,4種顏色樣品間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的分布存在交叉信息與共有信息共存特征。4種顏色整體物質(zhì)信息組成顯示,紅芪藥材顏色的變化特征與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分存在聯(lián)系,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分對(duì)紅芪藥材顏色的形成具有貢獻(xiàn)。

圖6 不同顏色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素成分的PCA圖

3.4 不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的聚類(lèi)分析

分析不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物的聚類(lèi)特征,對(duì)不同顏色4組12份紅芪樣品17種類(lèi)胡蘿卜素代謝物含量數(shù)據(jù)采用UV(unit variance scaling)歸一化方法處理,通過(guò)R軟件ComplexHeatmap包中R程序腳本的繪制聚類(lèi)熱圖,對(duì)代謝物在不同顏色紅芪樣品間的積累模式進(jìn)行層次聚類(lèi)分析(hierarchical cluster analysis,HCA),代謝物和樣品同時(shí)進(jìn)行聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖7)。圖7左側(cè)聚類(lèi)線為代謝物聚類(lèi)線,中上方聚類(lèi)線為樣品聚類(lèi)線。由圖可知,4組12份樣品聚為4類(lèi),H2、H3、H8、H10、H11、H12聚為一類(lèi),H1、H5、H6、H9為一類(lèi),H4為一類(lèi),H7為一類(lèi),結(jié)合樣品信息表主觀顏色分類(lèi),H1、H2、H3為棕黃色,H4、H5、H6為紅棕色,H7、H9、H8為紅褐色、H10、H11、H12為黃棕色,說(shuō)明主觀顏色分類(lèi)與類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物分類(lèi)一致性不高,未嚴(yán)格按照4種顏色聚類(lèi),不同顏色的樣品間類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物種類(lèi)具有一定的同一性,同一顏色紅芪藥材樣品間類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物含量具有差異性,顏色與類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物含量間存在一定關(guān)系,不同顏色的紅芪樣品間存在差異性代謝物。

圖7 不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物聚類(lèi)熱圖

3.5 紅芪樣品色度值與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的相關(guān)性分析

圖8 紅芪樣品色度值與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 不同顏色紅芪樣品類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物篩選

為進(jìn)一步分析HC1組棕黃色、HC2組紅棕色、HC3組紅褐色、HC4組黃棕色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的差異性規(guī)律及差異性代謝物,建立正交偏最小二乘法判別分析模型(OPLS-DA),分別比較HC1與HC2,HC1與HC3,HC1與HC4,HC2與HC3,HC2與HC4,HC3與HC4間的差異性代謝產(chǎn)物。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)合了正交信號(hào)矯正(OSC)和PLS-DA方法,能夠?qū)矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類(lèi)信息,通過(guò)去除不相關(guān)的差異來(lái)篩選差異變量。OPLS-DA對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后,再進(jìn)行中心化處理,然后利用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)進(jìn)行OPLS-DA模型建立,根據(jù)OPLS-DA模型分析代謝組數(shù)據(jù),繪制各分組的得分圖,進(jìn)一步展示各個(gè)分組之間的差異,篩選變量重要性投影VIP值≥1的代謝物,作為差異性代謝物。評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)參數(shù)有R2X、R2Y和Q2,其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力,理論上接近于1時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠,值越低說(shuō)明模型的擬合準(zhǔn)確性較差,Q2≥0.4較為理想,Q2>0.9時(shí)為出色的模型[22]。

HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4間的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)差異性代謝產(chǎn)物OPLS-DA模型見(jiàn)圖9。由圖9可知,HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4等6個(gè)比較組的OPLS-DA模型中R2X、R2Y和Q2值符合要求,初步獲得OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP≥1的代謝物,篩選出的不同顏色紅芪樣品間差異類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝物具有意義。

圖9 不同顏色紅芪OPLS-DA模型

基于OPLS-DA結(jié)果,從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP值,初步篩選出不同顏色紅芪樣品間差異類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝物。因代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有“高維、海量”的特點(diǎn),因此需要結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元統(tǒng)計(jì)分析的方法,并根據(jù)數(shù)據(jù)特性從多角度分析,最終準(zhǔn)確地挖掘差異代謝物。本研究不同組之間存在3個(gè)生物學(xué)重復(fù),因此采取差異倍數(shù)FC與VIP值相結(jié)合的方法來(lái)進(jìn)一步準(zhǔn)確篩選差異代謝物。對(duì)于兩組比較,選取VIP≥1的代謝物(VIP值表示對(duì)應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類(lèi)判別中的影響強(qiáng)度,一般認(rèn)為VIP≥1的代謝物則為差異顯著),同時(shí)選取FC≥2和FC≤0.5的代謝物(代謝物在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中差異為2倍以上或0.5以下,則認(rèn)為差異顯著)進(jìn)行差異性代謝產(chǎn)物篩選,HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4間的類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)差異性代謝產(chǎn)物見(jiàn)表8。由表8可知,HC1棕黃色與HC2紅棕色、HC1棕黃色與HC3紅褐色、HC1棕黃色與HC4黃棕色、HC2紅棕色與HC3紅褐色、HC2紅棕色與HC4黃棕色、HC3紅褐色與HC4黃棕色的差異性類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物分別為6個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、6個(gè),4種顏色間涉及的差異性代謝產(chǎn)物主要為10種,分別為Car_01(α-胡蘿卜素)、Car_04(β-胡蘿卜素)、Car_15(葉黃素二月桂酸酯)、Car_17(葉黃素二肉豆蔻酸酯)、Car_27(紫黃質(zhì)二丁酸酯)、Car_29(紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯)、Car_55(花藥黃質(zhì))、Car_56(玉米黃質(zhì))、Car_57(紫黃質(zhì))、Car_59(葉黃素),棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品的顏色形成可能與上述代謝產(chǎn)物有關(guān)。

表8 不同顏色紅芪類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)差異性代謝產(chǎn)物

4 討論與結(jié)論

類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分檢測(cè)結(jié)果顯示,不同顏色紅芪樣品中共計(jì)檢測(cè)68種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分,其中檢測(cè)出17種成分,包含2種胡蘿卜素與15種葉黃素類(lèi)成分,未檢出的代謝產(chǎn)物可能是因不含此類(lèi)成分或者其含量低于儀器的檢測(cè)限度。進(jìn)一步對(duì)其含量分析發(fā)現(xiàn),4種顏色樣品間17種類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分含量存在極大值與極小值的特征,在不同顏色紅芪樣品中的分布具有差異性,4種顏色樣品間葉黃素、玉米黃質(zhì)兩種成分具有顯著性差異(P<0.05),其他15種成分差異性未達(dá)顯著。藥材中類(lèi)胡蘿卜素等成分的合成受到光、采收、產(chǎn)地加工及炮制的影響,因此差異性的形成可能與這些因子的綜合作用有關(guān)[10]。

PCA研究結(jié)果顯示,4種顏色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的分布存在交叉信息與共有信息共存特征。紅芪藥材顏色的變化特征與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物存在聯(lián)系,類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分對(duì)紅芪藥材顏色的形成具有貢獻(xiàn)。HCA結(jié)果顯示,主觀顏色分類(lèi)與類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物分類(lèi)一致性不高,未嚴(yán)格按照4種顏色聚類(lèi),不同顏色的樣品間類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物種類(lèi)具有一定的同一性,同一顏色紅芪藥材樣品間類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物含量具有差異性,顏色與類(lèi)胡蘿卜素代謝產(chǎn)物含量間存在一定關(guān)系,不同顏色的紅芪樣品間存在差異性代謝物,與PCA得到的結(jié)果具有相似性。

OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP與差異倍數(shù)值相結(jié)合的方法篩選不同顏色紅芪間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示,HC1棕黃色與HC2紅棕色、HC1棕黃色與HC3紅褐色、HC1棕黃色與HC4黃棕色、HC2紅棕色與HC3紅褐色、HC2紅棕色與HC4黃棕色、HC3紅褐色與HC4黃棕色的差異性類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物分別為6個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、6個(gè),4種顏色間涉及的差異性代謝產(chǎn)物主要為10種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)二丁酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素。

結(jié)合其他分析結(jié)果,與顏色值具有顯著關(guān)系的兩種成分為β-隱黃質(zhì)月桂酸、紫黃質(zhì)二丁酸酯,不同顏色紅芪樣品間類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分單因素方差分析具有顯著性差異的葉黃素、玉米黃質(zhì)兩種成分,因此,與紅芪顏色有相關(guān)性的成分主要有11種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)二丁酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、β-隱黃質(zhì)月桂酸,可分為胡蘿卜素類(lèi)與葉黃素類(lèi)兩類(lèi)。因植物細(xì)胞中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的累積受到合成、降解、存儲(chǔ)等方式的多層次調(diào)控[23,24],同時(shí)藥材的生產(chǎn)還涉及“種、采、制、用”等過(guò)程的影響,因此藥材所含類(lèi)胡蘿卜素的總體含量不僅與生物合成途徑上的內(nèi)部因素有關(guān),而且受到外部因素的調(diào)控,綜合作用使不同商品藥材中類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分含量及種類(lèi)具有差異性,從而使植物表現(xiàn)出不同的顏色。

顏色是電磁輻射或光作用于人體視覺(jué)器官后產(chǎn)生的一種心理感受,受到物理性質(zhì)與心理感受的共同影響,其本質(zhì)是連續(xù)的物理光譜[1]。藥材的呈色機(jī)理主要與其呈色物質(zhì)的共軛體系結(jié)構(gòu)密切相關(guān),分子共軛體系中的π→π*躍遷和含有雜原子的不飽和有機(jī)物的p→π共軛體系中的n→π*或n→σ*躍遷是其呈色的主要原因[1,25]。不同顏色紅芪樣品中類(lèi)胡蘿卜素成分屬于異戊二烯類(lèi)化合物,是紅芪的顯色成分之一,均含有很多的共軛雙鍵,棕黃色、黃棕色、紅褐色、紅棕色的紅芪可能是因其顯色成分(類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物)的“基態(tài)電子”分別吸收了它們的補(bǔ)色紫、綠色2種波段的光產(chǎn)生躍遷而呈色[1],另外,光輻射在傳播過(guò)程中遇到散射質(zhì)點(diǎn)后不同線度的散射質(zhì)點(diǎn)產(chǎn)生不同類(lèi)型的散射、折射、干涉及衍射[25],因此紅芪樣品棕黃色、黃棕色、紅褐色、紅棕色的產(chǎn)生可能與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)成分的共軛雙鍵的電子躍遷及光傳播至藥材時(shí)產(chǎn)生的散射、折射、干涉及衍射等物理現(xiàn)象有關(guān)。

綜上所述,棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品顏色值具有顯著差異性。其顏色值與類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物含量間存在關(guān)聯(lián)關(guān)系,4種顏色樣品間17種類(lèi)胡蘿卜素成分含量存在極大值與極小值的特征,含量分布具有差異性;4種顏色間涉及的差異性代謝產(chǎn)物包括胡蘿卜素類(lèi)與葉黃素類(lèi)2類(lèi)11種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)二丁酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、花藥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、β-隱黃質(zhì)月桂酸,其是紅芪產(chǎn)生顏色的呈色物質(zhì)之一。棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品的呈色原因可能與上述類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)代謝產(chǎn)物的含量及種類(lèi)有關(guān)。