細(xì)胞外液谷氨酸激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的離體實(shí)驗(yàn)研究*

左婷，高洋，石來(lái)敏，袁良杰

（山東第一醫(yī)科大學(xué)臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000）

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞，參與突觸、神經(jīng)回路和行為調(diào)節(jié)等功能［1］。星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元緊密嵌入腦組織，在突觸處共享突觸連接［2］谷氨酸（glutamate,Glu）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)細(xì)胞外液中殘留的Glu 通常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)興奮性毒性［3］。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)攝取突觸釋放到突觸間隙的Glu 防止Glu 興奮毒性［4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白清除細(xì)胞外液中殘留的Glu。細(xì)胞外Glu 刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣離子的釋放，觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞向相鄰神經(jīng)元釋放谷氨酸［5］。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)維持Glu 攝取和釋放保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Glu 的穩(wěn)態(tài)。大量研究表明，Glu 穩(wěn)態(tài)的打破與精神性疾病、阿爾茨海默病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等疾病的發(fā)生具有重要的關(guān)系［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，Glu 興奮毒性主要與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力受損有關(guān)［8］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是再攝取Glu 的主要細(xì)胞。然而，不同濃度的Glu 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響尚不清楚，因此本研究將揭示不同濃度Glu 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，這將為拮抗Glu 的興奮性毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

谷氨酸粉末由Sigma 公司提供；β-actin（ab8227）購(gòu)自Abcam（英國(guó)劍橋）；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）抗體由Cell Signaling Technology 公司提供；抗兔和抗鼠二抗購(gòu)自Absin Bioscience Inc.（中國(guó)上海）。DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司，胎牛血清購(gòu)自北京Cell Max 公司。

1.2 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及處理

采用1～2 d 新生SD 大鼠制備原代星形膠質(zhì)細(xì)胞［9］。從大鼠腦海馬組織中分離出星形膠質(zhì)細(xì)胞。取量大鼠腦兩側(cè)海馬組織，0.125% 胰蛋白酶-0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）在37℃下消化海馬組織15 min。用含有10% FBS 的DMEM 終止消化。將海馬組織吹散成單個(gè)細(xì)胞，并以1×104/cm2的密度接種在含有10% FBS 的DMEM 的75 cm2培養(yǎng)皿中。24 h 后，用新鮮的完全培養(yǎng)基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM）替換培養(yǎng)基，并去除懸浮細(xì)胞。細(xì)胞在37℃、95% 空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約8 d，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到90%以上。以210 r/min（18 h，37℃）旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿用于收集純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞GFAP 陽(yáng)性染色率＞98%。不同濃度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）與細(xì)胞共同作用24 h。

1.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)

不同濃度谷氨酸刺激細(xì)胞24 h 后，棄掉培養(yǎng)板中的上清液，預(yù)冷的0.01 M PBS 沖洗3 遍，加入RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下，收集裂解液到離心管中，4℃ 12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，吸取上清液。采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度后，加入5×loading buffer 充分混勻，95℃孵育5 min；然后將蛋白保存于-80℃冰箱，用于Western blotting 檢測(cè)。將保存好的蛋白，按照每孔15 μg 的蛋白質(zhì)量進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，300 mA 恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，將帶有蛋白條帶的PVDF 膜封閉于5% 的脫脂牛奶1 h，然后一抗孵育，4℃搖床24 h；然后TBST 洗膜3 遍，二抗孵育，室溫1 h；然后加入發(fā)光液進(jìn)行蛋白檢測(cè)。采用Image J 軟件讀取蛋白灰度值，進(jìn)行蛋白含量的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Tukey 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度的谷氨酸對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 蛋白表達(dá)的作用

為了檢測(cè)不同濃度的外源性谷氨酸對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，本實(shí)驗(yàn)選用星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同濃度的谷氨酸處理星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，與0 μM 組相比，25 μM，50 μM，100 μM 的谷氨酸處理組GFAP 的蛋白表達(dá)均有上調(diào)的趨勢(shì)，100 μM 處理組GFAP表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 不同濃度的谷氨酸誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和IL-1β 蛋白的表達(dá)（）

表1 不同濃度的谷氨酸誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和IL-1β 蛋白的表達(dá)（）

注：?與0 μM 組比較，P＜0.05。

2.2 不同濃度谷氨酸誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子IL-1β 蛋白的作用

研究表明激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放炎性因子IL-1β，為了檢測(cè)不同濃度的谷氨酸是否能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的谷氨酸處理星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，利用Western blot 技術(shù)檢測(cè)炎性因子IL-1β 的表達(dá)，結(jié)果顯示，50 μM 和100 μM 谷氨酸處理組，IL-1β 蛋白的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)退行性疾病、精神性疾病的復(fù)雜病理機(jī)制。神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸/谷氨酰胺循環(huán)來(lái)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的平衡［4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)谷氨酸和離子穩(wěn)態(tài)、膽固醇和鞘脂代謝，并對(duì)環(huán)境因素刺激做出反應(yīng)，以上都是與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)［10］。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性神經(jīng)元釋放的最普遍的神經(jīng)遞質(zhì)之一；然而，細(xì)胞外空間中殘留的谷氨酸具有潛在的神經(jīng)毒性，突觸和突觸外谷氨酸的過(guò)量導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度興奮和神經(jīng)元死亡，這一過(guò)程被稱為“谷氨酸興奮毒性”［11］。正常情況下，谷氨酸在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的濃度很高，然而，在細(xì)胞外液中卻保持很低的水平約為3～4 μM［12-13］。因?yàn)樵谛切文z質(zhì)細(xì)胞存在清除過(guò)量谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將中樞神經(jīng)系統(tǒng)中90%的過(guò)量谷氨酸清除和轉(zhuǎn)運(yùn)［14-15］。目前尚不清楚細(xì)胞外高濃度谷氨酸是否能刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)？為了闡明這些現(xiàn)象，在本研究中，筆者用不同濃度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μM 組相比，100 μM 谷氨酸處理組GFAP 蛋白表達(dá)明顯升高，50 μM 和100 μM 谷氨酸處理組IL-1β蛋白水平明顯提高，這說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)量谷氨酸的過(guò)程中被激活，炎癥因子的釋放可能促進(jìn)谷氨酸在細(xì)胞間隙的進(jìn)一步釋放［16］，促炎因子水平增加，也會(huì)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的能力下降，從而形成炎癥反應(yīng)和谷氨酸興奮性毒性增加的惡性循環(huán)。然而，在高濃度谷氨酸的內(nèi)部環(huán)境中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是否發(fā)生了其他變化，還需要進(jìn)一步的整體動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了高水平的細(xì)胞外谷氨酸可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并釋放促炎細(xì)胞因子。本研究將為拮抗谷氨酸的興奮性毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。