繪制小鼠腦圖譜的探險

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空間轉錄組學技術MERFISH展現(xiàn)小鼠腦切片中各式各樣的細胞簇

圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾（Santiago Ramóny Cajal）在19世紀后期極為細致地描繪了神經(jīng)組織，對神經(jīng)生物學產(chǎn)生了革命性的影響。這位西班牙生理學家和科學家花費多年時間，一絲不茍地利用顯微鏡進行研究，通過圖像展現(xiàn)腦中獨特的細胞形態(tài)學。

“卡哈爾的工作讓我們意識到腦中的細胞與眾不同，細胞形態(tài)與其他器官的截然不同，這在其他地方是看不到的。”馬薩諸塞州坎布里奇麻省理工-哈佛大學博德研究所的神經(jīng)科學家埃文·馬科斯科（Evan Macosko）評價道。

拉蒙-卡哈爾繪制的圖像為腦如何實現(xiàn)其功能提供了最初的線索：腦從調(diào)控血壓和睡眠到控制認知和情緒，或許都能夠定位到細胞層面。

然而，腦的關鍵信息卻依舊是空白。哈佛大學生物物理學家莊小威認為：為了從基礎層面理解腦，我們迫切需要明確其中的細胞種類、細胞的組織方式，以及細胞間如何交互。

莊小威繼續(xù)解釋道，神經(jīng)科學家需要的是一種系統(tǒng)鑒定腦細胞種類，并繪制圖譜的方法。如今研究者正接近這一目標（至少在小鼠腦中）。通過結合高通量單細胞RNA測序和空間轉錄組學——這些技術能夠鑒定單個細胞內(nèi)的基因表達情況，以及這些細胞的定位——研究者正繪制迄今為止最為全面的小鼠腦圖譜。關鍵的后續(xù)步驟在于研究這些分子水平鑒定得到的細胞種類的具體功能，并結合各種腦圖譜以創(chuàng)建統(tǒng)一的圖譜資源，廣泛應用于神經(jīng)科學研究領域。

繪制腦圖譜

小鼠是極為強大的實驗平臺，神經(jīng)科學家可以在小鼠中以各種無法在人腦中實現(xiàn)的方式研究腦的功能。光遺傳學（利用經(jīng)過基因改造的實驗動物，科學家可以通過光來控制細胞的活動）等工具能夠探究特定神經(jīng)元如何影響行為，而這些操縱手段無法用于人類，也不符合倫理規(guī)范。

單細胞腦圖譜通過基因表達譜鑒定細胞種類，這種方法可以溝通這兩個物種。斯德哥爾摩卡羅林斯卡研究所的神經(jīng)科學家司登·林納爾松（Sten Linnarsson）表示，如果研究者對人類的特定細胞種類感興趣，可以利用基因表達模式尋找到小鼠中的同種細胞，并加以操縱?；虮磉_同樣為研究者提供了一種鑒定腦細胞更加細致的方法，使得傳統(tǒng)上利用物理結構、定位、細胞連接和放電模式的方法顯得相當粗糙。

林納爾松等人利用單細胞RNA測序繪制了這種綜合性的圖譜。早期研究主要聚焦特定腦區(qū)，比如大腦皮層——這是腦的外層。接著在2018年，兩個研究團隊將這種技術拓展到了全腦水平。林納爾松團隊的一個研究對小鼠腦細胞、脊髓和外周神經(jīng)系統(tǒng)中接近50萬個細胞進行了分析。利用計算機算法基于基因表達模式對細胞進行分類，研究團隊發(fā)現(xiàn)了265個“細胞簇”，每個簇代表一種在分子水平上不同的細胞種類。而馬科斯科參與其中的哈佛大學醫(yī)學院和博德研究所的另一項研究，則在69萬個小鼠腦細胞中鑒定得到了565個細胞簇。

這些細胞簇中包含一些從未被報道過的細胞類型。以林納爾松的研究為例，發(fā)現(xiàn)了7種星形細胞，這是一種非神經(jīng)元細胞，功能相當豐富，從為神經(jīng)元提供能量到維持神經(jīng)元連接。而在這之前，科學家只鑒定出4種主要的星形細胞種類。

然而，明確存在的細胞種類并不等于明確其定位?！皟善撐闹卸既狈臻g維度?！瘪R科斯科評論道。

研究者需要一種方法在鑒定每個細胞中基因表達的同時，還要精確定位細胞在腦中的位置。這時，空間轉錄組學便有了用武之地。

描繪細胞多樣性

2015年，莊小威團隊首次公布了一種空間轉錄組技術——多重抗誤差矯正熒光原位雜交（MERFISH）技術。該技術為每一種RNA分配條碼（一個獨特的DNA探針），并進行數(shù)輪顯微成像系統(tǒng)性地破解條碼。這些條碼具有“抗誤差”的功能：這些序列即使被誤讀數(shù)次，也不會被錯認為其他條碼。

MERFISH能夠在培養(yǎng)的人類細胞中同時解析超過1 000個基因，研究者也嘗試利用這一技術解析小鼠的腦，建立特定腦區(qū)的圖譜并比較鼠腦和人腦間的細胞組織差異。此外，他們還發(fā)現(xiàn)人的部分大腦皮層相比小鼠對應腦區(qū)，含有膠質(zhì)細胞（一組非神經(jīng)元細胞，包括星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞——腦中特有的免疫細胞）的比例更高，以及人大腦皮層神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞間的交互相對于小鼠要更多。

現(xiàn)如今，莊小威和同事們將MERFISH技術應用于全腦水平。研究團隊利用這一技術解析成年小鼠腦中約800萬個細胞，并將這些數(shù)據(jù)與同一批細胞的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)相整合，發(fā)現(xiàn)了超過5 000個具有不同轉錄組特征的細胞簇。研究團隊于2023年3月將這一結果以預印本的形式發(fā)表于《生物學檔案》（bioRxiv），這些研究的正式結果也正陸續(xù)出版。

另一個同類研究由華盛頓西雅圖艾倫腦科學研究所所長曾紅葵指導進行，同樣將單細胞RNA測序與MERFISH技術相結合。（曾紅葵和莊小威的研究團隊都參與了上述兩項研究。）盡管這兩項研究應用的技術相似，關注的其實是不同的問題。第一個研究的重點在于空間梯度——這是一種細胞簇間的基因表達譜的漸變特征，以及空間模塊，即分子水平上具有差異的腦區(qū)。第二個研究則通過DNA結合蛋白，即轉錄因子來鑒定不同的細胞種類?！拔覀兊慕Y果僅僅是皮毛，”莊小威表示，“這一數(shù)據(jù)集為腦的分子和細胞結構提供了豐富的見解，也為將來的研究提供了富有價值的資源。”

第三個研究則由馬科斯科和同事完成，他們利用一種不同的空間組學方法。馬科斯科并沒有使用依賴顯微鏡的MERFISH技術，而是采取Slide-seq測序方法。這一技術能夠?qū)⒔M織樣本中的細胞RNA高效地轉移到種滿微珠的表面，而這些微珠帶有條碼標記。研究人員可以利用已知的帶條碼微珠的定位，明確組織中相關RNA的具體位置。而將這種技術和單核RNA測序相結合，就能夠報告細胞核中的基因轉錄情況，而非整個細胞的情況。由此，馬科斯科團隊繪制了自己的小鼠腦圖譜。

這三項研究或多或少都受到了美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）腦計劃細胞普查網(wǎng)絡（BICCN）的資助，這項計劃支持實驗室繪制小鼠及包括人類在內(nèi)的靈長類腦的綜合圖譜。而三項研究都指向相似的結論：小鼠的腦在細胞多樣性上相當復雜，這種復雜性更加體現(xiàn)在皮層外的其他部分。研究團隊發(fā)現(xiàn)皮層中細胞的種類更少，不同種細胞所具有的轉錄特征差異性更大。而位于腦底部的下丘腦、中腦和后腦等區(qū)域則具有更多種類的細胞，且細胞間差異性更小。

曾紅葵推測這些差異源自這些區(qū)域不同的演化史。下丘腦、中腦和后腦等區(qū)域主要負責重要的生理功能，譬如進食、代謝和運動，這些功能在動物間是保守的，因此具有相對固定的細胞配置，長時間以來形成不再變化的高度特異細胞。但皮層則負責更高級的認知功能，負責適應環(huán)境變化，這些細胞出現(xiàn)差異化表現(xiàn)的頻率就會更高。

馬科斯科的數(shù)據(jù)目前公開發(fā)布在braincelldata.org，另外兩項研究的數(shù)據(jù)則在brainimagelibrary.org；同時，莊小威表示艾倫研究所計劃2023年發(fā)布一個新的交互網(wǎng)站。

小腦切片的熒光顯微照片

“這些絕對稱得上美妙的研究，”卡羅林斯卡研究所的神經(jīng)科學家康斯坦丁諾斯·美萊迪斯（Konstantinos Meletis）評價道，“這些研究說明目前可以利用大規(guī)模靶向方法同時理解成百上千的基因的空間組織形式。”美萊迪斯和同事們在三年前發(fā)表了自己的小鼠全腦圖譜，他們用到了不同的空間轉錄組方法。（這項研究沒有在單細胞水平繪制全腦圖譜，但在特定區(qū)域內(nèi)說明了這項技術可以與單細胞RNA測序相結合以獲得細胞水平的分辨率）。

超越基因表達

“單細胞基因表達圖譜是神經(jīng)科學領域的無價之寶?！痹t葵評價道。從分子特征角度準確定位特定細胞種類后，神經(jīng)科學家便可以此開發(fā)工具研究健康腦中特定細胞的功能，并進一步研究疾病狀態(tài)下的情況。

而研究者正繪制的圖譜可不止這一種。

加州大學圣地亞哥分校的分子遺傳學家任冰與加州拉荷亞索爾克研究所的分子生物學家喬·?？耍↗oe Ecker）合作，繪制了小鼠腦的表觀遺傳學圖譜。?？说膶嶒炇议_發(fā)了一種檢測DNA甲基化（一種DNA上的化學修飾，能夠改變基因表達）的工具，適用于單個細胞的整個基因組，而任冰團隊則設計了一種解析染色體可及區(qū)域的工具，能夠標記活躍的基因表達和調(diào)控區(qū)域?！拔覀兿Ｍㄟ^不同細胞類型中的甲基化情況，從另一角度定義細胞的身份，”任冰表示，“這種方法在鑒定不同腦細胞的同時，也能更綜合地理解每種細胞類型基因調(diào)控的機制。”

任冰和?？藢⑦@些技術相結合，在小鼠腦中鑒定出了超過4 000種細胞簇。研究團隊于四月在《生物學檔案》（ArchivesofBiologicalSciences）上發(fā)表了這項研究，報告了他們發(fā)現(xiàn)的細胞種類與空間轉錄組學技術的鑒定結果很相似。這項研究同樣是BICCN計劃的一部分。

與此同時，中國科學院神經(jīng)科學研究所的神經(jīng)科學家嚴軍和同事正在繪制腦內(nèi)神經(jīng)元細胞間的遠程連接，即“投射組”圖譜。他們開發(fā)出一種計算機算法，在小鼠的前額葉皮層（在人類中對應的腦區(qū)參與決策、情感和感知等功能）中通過追蹤軸突（將信號從神經(jīng)細胞胞體中傳遞出去的長纖維）的投射鑒定出這些神經(jīng)元連接。研究團隊進一步將研究范圍擴展到樹突（神經(jīng)細胞接受信號的枝干），并將全腦的投射組作為目標。

“神經(jīng)系統(tǒng)是一個網(wǎng)絡，”嚴軍解釋說，“而網(wǎng)絡的功能取決于其連接性?！?/p>

還有一些科學家在這一領域耕耘已久。美國赫爾希賓夕法尼亞州立大學的神經(jīng)科學家金永洙（Yongsoo Kim）正利用高分辨率成像技術繪制小鼠腦從胚胎階段開始的發(fā)育全過程的3D圖譜。金永洙表示，目前只有一個成年小鼠腦的“極好的”參考圖譜——艾倫小鼠腦通用坐標框架，該框架由1 600個鼠腦的高分辨率圖像制成。但這一圖譜也只代表某個單一的時間點。金永洙團隊希望通過繪制更加通用的坐標框架，為繪制不同發(fā)育階段的小鼠腦圖譜提供模板。

從小鼠到人

目前，研究人員正將這些技術用于更大型的哺乳動物，包括人類。NIH 2022年宣布投入5億美元資助腦計劃細胞圖譜網(wǎng)絡（BICAN），以建立更加綜合的人腦圖譜。

但繪制人腦圖譜的挑戰(zhàn)更大：一方面，人腦相對于小鼠腦的細胞數(shù)量估計要多上千倍。同時，科學家處理人腦組織的實驗手段也有限——組織樣本必須來自尸腦樣本，同時人類樣本相比實驗小鼠的異質(zhì)性更大，實驗小鼠往往具有一致的遺傳背景，飼養(yǎng)環(huán)境也類似。

盡管如此，人腦研究已經(jīng)帶來了新發(fā)現(xiàn)。林納爾松和同事在一項分析中利用單核RNA測序調(diào)查人腦中300萬個細胞。研究結果于2022年10月在《生物學檔案》中上線，他們發(fā)現(xiàn)人腦的中腦和后腦等區(qū)域中細胞種類相對于皮層更多，這與小鼠中發(fā)現(xiàn)的一致?！拔覀冊谌祟愔型扇∫环N皮層為中心的觀點?！绷旨{爾松評價道，但這些發(fā)現(xiàn)提示研究者應該更加重視其他常被忽略的腦區(qū)。

與此同時，研究者繼續(xù)深入研究空間細胞圖譜，探索這些新鑒定得到的細胞種類的功能。譬如莊小威團隊，正在探究不同細胞種類的空間臨近關系以及它們的基因表達模式，以推斷細胞間的交互作用，這能夠為剖析各種腦功能的分子和細胞機制提供重要的線索。同時馬科斯科表示他的團隊正在開發(fā)一種算法，用于決定區(qū)分細胞種類所需基因數(shù)的最小值——猶如是給神經(jīng)科學家一本實驗用的“食譜”。

研究者甚至可以通過挖掘這些圖譜的數(shù)據(jù)開發(fā)療法。目前精神和神經(jīng)疾病的治療方法傾向于使用粗略的細胞分類方法——例如靶向多巴胺能或血清素能神經(jīng)元。但上述的圖譜提示我們腦中細胞有上千種，其中或許就隱藏著調(diào)控人類行為的全新方法?！皬闹委煹慕嵌葋砜?，”馬科斯科說，“我們在這一領域中有很大的機會研究發(fā)現(xiàn)不同的細胞種類如何影響認知、情緒，以及其他的生理學機制?！?/p>

資料來源Nature