樺木科葉綠體基因組密碼子偏好性及系統(tǒng)發(fā)育分析

郭佳星， 黃祥， 楊梅花， 王蕾蕾， 韓彥奇， 李卓怡

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

樺木科（Betulaceae）屬于雙子葉植物綱殼斗目（Fagales），由6 個屬約130 個種組成，各屬在中國均有分布，共74 個種[1-2]。該科可分為2 個亞科[3]，其中榿木屬（Alnus）和樺木屬（Betula）屬于樺木 亞 科（Betuloideae）；其 他4 個 屬 為 榛 亞 科（Coryloideae）。樺木科植物是具有重要生態(tài)防護(hù)功能的造林先鋒樹種，同時，樺木科植物樹形優(yōu)美，還是優(yōu)良的園林綠化樹種[4]。

植物葉綠體是參與植物細(xì)胞光合作用、氮代謝、脂肪酸和核酸合成等多種功能過程的關(guān)鍵質(zhì)體[5]。植物葉綠體具有獨特的基因組，其構(gòu)造單一，遺傳上比較保守，被廣泛應(yīng)用于進(jìn)化分析和質(zhì)體工程[6-7]。葉綠體基因組中rbc L、matK和trn L~trn F等基因序列被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究，其中matK基因是葉綠體基因中進(jìn)化較快的基因之一，在科、屬水平，該序列為研究類群內(nèi)部的系統(tǒng)重建提供了較多的信息和較高的支持率。matK序列的核苷酸變化在種間、種內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化研究中也具有重要價值[8-10]。近年來，由于基因高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多樺木科植物的葉綠體基因通過NCBI （National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫已共享，這些分子信息有助于植物的進(jìn)化分析和質(zhì)體工程研究[11]。

在生物體基因表達(dá)過程中，同義密碼子的使用頻率不同形成了密碼子使用偏好性（codon usage bias, CUB）[12-13]。其受堿基突變、環(huán)境因素、長期進(jìn)化過程中基因漂移以及基因表達(dá)水平等因素影響，其中自然選擇和突變是主要因素[14-15]。研究密碼子偏好性有助于優(yōu)化密碼子，不僅能夠提高轉(zhuǎn)基因研究中外源序列的表達(dá)效率，還能促進(jìn)物種進(jìn)化研究[16]。目前，樺木科葉綠體基因組的相關(guān)研究主要以科內(nèi)個體縱向之間系統(tǒng)發(fā)育研究為主[17-19]，缺乏不同種間密碼子使用偏好性的橫向系統(tǒng)研究。

本研究以樺木科6個屬50個種的葉綠體基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地分析了樺木科葉綠體基因組密碼子使用偏好性及其影響因素，進(jìn)一步確定用于葉綠體基因工程的最佳密碼子，并基于同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）和matK基因序列比較了樺木科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究結(jié)果不僅為樺木科植物的遺傳進(jìn)化研究提供思路，也為種質(zhì)資源開發(fā)利用和葉綠體基因工程研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)獲取

樺木科50 個物種的葉綠體基因組數(shù)據(jù)來源于NCBI 數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.），登錄號詳見表1，并篩選長度大于300 bp 的基因序列用于進(jìn)一步分析[20]。

1.2 研究方法

1.2.1 密碼子相關(guān)參數(shù)計算 使用CodonW1.4.2軟件分析50 種樺木科植物葉綠體篩選出的基因序列，計算相關(guān)參數(shù)，包括同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index, CAI）、同義密碼子GC3s含量和密碼子第3位各堿基的含量。使用在線程序CUSP（http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/）計算密碼子第1位、第2位、第3位堿基的GC 含量（用GC1、GC2和GC3表示）和密碼子平均GC含量（用GC表示）。

1.2.2 相關(guān)性分析 運用R 語言環(huán)境下Hmisc 軟件包的Spearman 秩相關(guān)系數(shù)法對樺木科葉綠體各基因密碼子相關(guān)參數(shù)間進(jìn)行相關(guān)分析，并使用Performance Analytics 軟件包的chart.Correlation 命令繪圖。

1.2.3 中性繪圖分析 對GC3 和GC12（GC1 與GC2 的平均值）繪制散點圖，然后分析相關(guān)性，通過結(jié)果的顯著與否來確定密碼子偏好性的主要影響因素[21]。

1.2.4 ENC-plot 分 析 以GC3 和ENC 分 別 作X和Y軸，進(jìn)行ENC-plot 繪圖，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如公式（1）所示。通過分析基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線的位置關(guān)系，判斷密碼子偏好性的主要影響因素[8]。

1.2.5 PR2-plot 分析 分別計算篩選后基因密碼子的G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)值，進(jìn)行PR2-plot 繪圖。圖中中心點（0.5,0.5）為A=T 且C=G，表示密碼子無使用偏好性，通過圖中基因位點和中心點的比較，判斷其偏倚程度及方向[9]。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析 選取篩選后基因密碼子ENC 值靠前10%和靠后10%的基因，構(gòu)建高偏好性和低偏好性庫。對2 個庫中密碼子的RSCU 值和ΔRSCU值進(jìn)行計算，以ΔRSCU≥0.08且RSCU>1為條件確定最優(yōu)密碼子[20]。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析 基于葉綠體基因組密碼子RSCU 值，運用SPSS 25.0的離差平方和法（Ward’s method）對50 種樺木科植物進(jìn)行聚類分析?；谌~綠體matK基因序列，運用MEGA 7.0 的最大鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建50 種樺木科植物系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成特征分析

由表1 可知，樺木科6 個屬50 個種之間的葉綠體基因密碼子不同位置堿基的GC 含量存在差異，表現(xiàn)為GC1（45.4%）>GC2（37.4%）>GC3（29.7%），平均GC 含量為37.6%，表明密碼子偏好使用以A/U結(jié)尾；密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）為0.163~0.166，平均0.165，即CAI 值較低；有效密碼子數(shù)（ENC）為49.29~50.46，平均49.78，ENC 值均大于45。由此表明，樺木科葉綠體基因組密碼子偏好性弱。

2.2 相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果（表2）表明，在50種樺木科植物葉綠體基因組密碼子中GC1與GC2、GC2與GC3呈極顯著相關(guān)；GC1 與GC3 相關(guān)不顯著；GC1、GC2、GC3均與平均GC含量呈極顯著相關(guān)；這表明樺木科植物葉綠體基因密碼子各堿基的組成整體相關(guān)性不大。ENC 與CAI 呈顯著負(fù)相關(guān)，與GC2、GC3呈極顯著正相關(guān)，表明GC2和GC3越高，50種樺木科植物葉綠體基因組密碼子偏好性越弱。

表2 基因密碼子各參數(shù)之間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between the indexes of codon use

2.3 密碼子使用偏好性影響因素分析

在樺木科6個屬中分別選取2個代表物種，包括鵝耳櫪屬（Carpinus）中的美洲鵝耳櫪（C. caroliniana）和千金榆（C. cordata）、虎榛子屬（Ostryopsis）中的虎榛子（O. davidiana）和滇虎榛（O. nobilis）、樺木屬中的沼樺（B. nana）和白樺（B. platyphylla）、榿木屬中的榿木（A. cremastogyne）和紅榿木（A. rubra）、鐵木屬（Ostryopsis）中的鐵木（O. japonica）和毛果鐵木（O.trichocarpa）、榛屬(Corylus)中的美洲榛（C. americana）和華榛（C. chinensis），進(jìn)一步分析樺木科葉綠體基因組密碼子偏好性的影響因素。

2.3.1 中性繪圖分析 由圖1 可知，GC3 的分布區(qū)域較小（0.205 9~0.366 3），GC12 分布范圍較大（0.306 8~0.550 4），對角線上方有較多基因分布，僅有少部分基因沿對角線分布，表明第3 位堿基組成和第1、2 位堿基組成并不呈線性相關(guān)；線性回歸系數(shù)較?。?.009 49~0.046 37），表明突變對基因組密碼子使用偏好性影響最高僅占4.637%。因此，12 種樺木科植物葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受自然選擇影響，同時也受到突變作用的影響。

2.3.2 ENC-plot 分析 由圖2 可知，12 種樺木科植物葉綠體基因在圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線兩側(cè)呈小簇狀分布，且主要分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，其ENC 期望值大于實際值。由此表明，12 種樺木科植物葉綠體基因組密碼子使用偏好性除自然選擇因素影響外，部分基因受到突變作用影響。

圖2 ENC-plot 分析Fig. 2 Analysis of ENC-plot

2.3.3 PR2-plot 分析 由圖3 可知，基因數(shù)量在圖中4 個區(qū)域中分布不均勻。在豎直方向，大部分基因匯集于中線下方；在水平方向，基因在中線兩側(cè)分布差異不顯著，表明樺木科植物葉綠體基因組密碼子第3 位堿基組成中堿基A 的頻率小于堿基T，堿基C的頻率和堿基G差異較小。該結(jié)果進(jìn)一步表明，樺木科植物葉綠體基因組密碼子使用偏好性在一定程度上受到堿基突變的影響。

圖3 PR2-plot 分析Fig. 3 Analysis of PR2-plot

2.4 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)ENC 值對50 種樺木科植物葉綠體基因組的高表達(dá)和低表達(dá)基因建庫，并計算高、低2庫的RSCU 和ΔRSCU。結(jié)果（圖4）顯示，樺木科植物葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子的數(shù)量在25~30之間，密碼子CUC、CUG、AUC、GUC、GUG、GGG、UGC、CCA、ACG、GCC、CGA、CGG、CAG、GAG、AGG 為共有的最優(yōu)密碼子。其中以G 結(jié)尾的密碼子占最優(yōu)密碼子總數(shù)的53.3%，以C 結(jié)尾的占33.3%，即最優(yōu)密碼子第3 位堿基偏向于G 和C 結(jié)尾。此外，不同屬內(nèi)種間共有最優(yōu)密碼子數(shù)量存在差異，鵝耳櫪屬、鐵木屬和榛屬均有28個，虎榛子屬有26個，樺木屬和榿木屬有19個。

圖4 最優(yōu)密碼子分析Fig. 4 Analysis of optimal codons

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)葉綠體基因組密碼子的RSCU 值對50種樺木科植物進(jìn)行聚類分析（圖5A），在歐氏平方距離18.82 處，天臺鵝耳櫪（C. tientaiensis）單獨聚成1 支，其他49 種樺木科植物聚成1 個大支；在歐氏平方距離16.37 處，9 種樺木屬物種單獨聚成1 支；在歐氏平方距離14.27 處，5 種榿木屬和13 種榛屬物種聚成1 支，3 種虎榛子屬、3 種鐵木屬和15 種鵝耳櫪屬物種聚成1 支，同一分支內(nèi)的樺木科物種存在相近的密碼子使用偏好性。由圖5B 可知，除樺葉鵝耳櫪外，基于matK基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析能夠?qū)迥究撇煌锓N的親緣關(guān)系進(jìn)行到屬間的劃分。整體上看，基于matK基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和基于葉綠體基因組密碼子RSCU 值的聚類結(jié)果相似。親緣關(guān)系比較近的物種如鐵木屬、鵝耳櫪屬和虎榛子屬，其密碼子使用偏好性比較相似；但也存在親緣關(guān)系相近而密碼子使用偏好性存在較大差異的現(xiàn)象，如天臺鵝耳櫪和另外15 種鵝耳櫪屬，其物種密碼子使用偏好性差別較大。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，不同物種間的葉綠體基因組密碼子使用偏好性和物種進(jìn)化兩者間有時并不完全相關(guān)，但存在不同屬間的差異性和屬內(nèi)物種間的相似性。

圖5 聚類分析Fig. 5 Cluster analysis

3 討論

生物在進(jìn)化過程中會以特定的密碼子模式來適應(yīng)進(jìn)化、自然選擇和突變等[15]。密碼子的堿基序列組成對密碼子的使用偏好性存在一定程度的影響[22]。密碼子第3 堿基的同義突變雖不會改變氨基酸的類型，但卻對決定氨基酸種類具有重要作用，因此GC3 是密碼子偏好性分析的重要指標(biāo)[23]。在以往的研究中，雙子葉植物中GC3 通常小于50%，即密碼子更偏好于以A/U 結(jié)尾，而在單子葉植物中卻相反[24]。本研究結(jié)果與多數(shù)雙子葉植物的研究結(jié)果較為一致。樺木科植物葉綠體基因組密碼子CAI值較低，而ENC值相對較高，說明樺木科葉綠體基因組密碼子偏好性較弱，這或許與其葉綠體基因的功能相對較為穩(wěn)定、保守有關(guān)[25]。

研究表明，若密碼子GC12 與GC3 無顯著相關(guān)，且GC3 值分布范圍較小時，自然選擇是密碼子偏好性的主要影響因素[26-27]。本研究表明，樺木科植物葉綠體基因組密碼子GC3 分布范圍較?。?.205 9~0.366 3），且GC3 與GC1、GC2 無顯著相關(guān)性。因此，樺木科葉綠體基因組密碼子使用偏好性的主要影響因素是自然選擇。同時，ENCplot 和PR2-plot 研究結(jié)果進(jìn)一步證實了該結(jié)論。這與木蘭科[28]研究結(jié)果一致，但與槲蕨屬[29]和秋茄[25]等植物中的研究結(jié)果存在差異。

研究生物體中最優(yōu)密碼子有助于最大限度地提高翻譯速度和提高翻譯準(zhǔn)確性[15]。本研究中，50 種樺木科植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的數(shù)量在25~30 之間，表明樺木科不同物種在適應(yīng)自然選擇過程中其最優(yōu)密碼子使用策略存在差異。本研究檢測到的共有最優(yōu)密碼子為15 個，且第3 位堿基更偏好于使用G/C結(jié)尾，這與大部分雙子葉植物密碼子偏向于以A/U 結(jié)尾特征存在差異[30-31]，但和西南樺的研究結(jié)果相一致[32]，這可能是該科植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子使用的一種特殊機制。

基于密碼子使用偏好性進(jìn)行聚類分析在一定程度上能夠反映物種間的親緣關(guān)系[33]。本研究基于 RSCU 值的聚類結(jié)果和基于matK基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，兩者的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似。其中，除天臺鵝耳櫪外，基于RSCU 值的聚類將樺木科植物實現(xiàn)亞屬的劃分；而基于matK基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能夠?qū)?0 種樺木科植物進(jìn)行到亞科的劃分。由此表明，基于密碼子RSCU 值的聚類結(jié)果和傳統(tǒng)樺木科的種屬分類結(jié)果[17]存在一定程度差異，這可能與樺木科不同物種在進(jìn)化過程中其葉綠體基因組密碼子偏好性受自然選擇、突變等因素影響程度存在種間差異有關(guān)。因此，密碼子RSCU 值的聚類分析在較小型的分類單元中可以提供更加可信的結(jié)論，而在較大型的分類單元中只能作為傳統(tǒng)分類的補充[25]。