養(yǎng)雞發(fā)酵床墊料中脫硫菌的分離及鑒定

徐慶賢劉蕓阮傳清羅曉建

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003)

伴隨著養(yǎng)雞集約化產(chǎn)生的大量糞便造成環(huán)境污染，已經(jīng)成為制約養(yǎng)雞業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約性因素。雞糞由于其高蛋白質(zhì)導(dǎo)致的強(qiáng)烈惡臭，在各種畜禽糞便中，比牛糞、豬糞危害更大，也更難處理[1]。雞糞經(jīng)微生物分解后，會(huì)產(chǎn)生硫化氫(H2S)、氨氣(NH3)揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)等氣體的排放，對(duì)人畜健康產(chǎn)生不利影響[2]，其中硫化氫是廢氣臭味的主要來(lái)源之一。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，提高糞污治理水平，可以大幅降低硫化氫、吲哚等惡臭氣體的產(chǎn)生和病菌傳播。微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)是一種畜禽糞污治理模式，其將稻殼、鋸末、秸桿等作物廢棄物粉碎，做成墊料層鋪設(shè)于養(yǎng)殖舍地面，再將動(dòng)物養(yǎng)殖于墊料層上[3]。雞糞便被墊料吸附、掩蓋，并在微生物的作用下消解，可以減少糞便污染環(huán)境。

人工加入微生物可以調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)、縮短發(fā)酵周期、提高發(fā)酵床運(yùn)行質(zhì)量，降低有害氣體的產(chǎn)生[4]，是發(fā)酵床運(yùn)行良好的關(guān)鍵因素。采用發(fā)酵床法養(yǎng)雞，在養(yǎng)殖過(guò)程中不需要對(duì)雞糞進(jìn)行人工清掃、貯存，也不用建沼氣池、污水池和糞場(chǎng)，運(yùn)行良好時(shí)可大幅降低氨氣、硫化氫等惡臭氣體，已在雞的養(yǎng)殖中得到推廣應(yīng)用[5，6]。

此外，在我國(guó)南方地區(qū)，夏季溫度高，雞發(fā)酵床墊料不宜鋪設(shè)太厚，這使得養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的硫化氫等惡臭氣體的控制更加困難。因此，有必要篩選更多的脫硫菌，為制備理想的發(fā)酵床復(fù)合菌劑，抑制雞舍硫化氫等惡臭氣體的產(chǎn)生提供菌種資源。由于發(fā)酵床墊料不僅是微生物分解雞糞的場(chǎng)所，同時(shí)也為這種分解提供碳源，本研究從養(yǎng)雞發(fā)酵床采集墊料，通過(guò)富集、分離和脫硫效果測(cè)定，獲得脫硫菌，為進(jìn)一步研發(fā)發(fā)酵床復(fù)合菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 墊料樣品

2022年11月14日在福建省順昌縣某發(fā)酵床養(yǎng)雞場(chǎng)采集墊料樣品。養(yǎng)雞大棚面積1000m2，發(fā)酵床墊料厚度40cm，雞品種為“優(yōu)公”，26日齡。按5點(diǎn)采樣法，在發(fā)酵床表面采集墊料，混合均勻，裝入干凈的自封袋，標(biāo)記，用實(shí)驗(yàn)冰袋冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，保存冰箱4℃冷藏備用。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

1.1.2.1 脫硫菌富集培養(yǎng)基

蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化鈉5g、硫化鈉2g，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.5，加入蒸餾水至1L，分裝至500mL三角瓶，121℃滅菌20min，備用。

1.1.2.2 脫硫菌分離平板

在脫硫菌富集培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，按17g·L-1濃度加入瓊脂，121℃滅菌20min，冷卻至50℃倒平板備用。

1.1.2.3 主要試劑

Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；PCR擴(kuò)增試劑(上海生工生物工程服務(wù)有限公司)；16S rDNA擴(kuò)增引物(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上海生物工程有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株富集、分離、純化

取墊料樣品10g，加入裝有90mL滅菌水的三角瓶(滅菌前瓶中裝入玻璃珠)，渦漩混合，再將三角瓶置于25℃，150r·min-1震蕩30min，取出靜置20min，移取上清液5mL至裝有100mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，放置于37℃，150r·min-1搖床培養(yǎng)2d。從培養(yǎng)液吸取5mL，轉(zhuǎn)移到新鮮富集培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，如此連續(xù)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)5代。處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

吸取最后1次培養(yǎng)液1mL，用無(wú)菌水稀釋10-4、10-5、10-6、10-7倍后，取0.1mL涂布于分離平板上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。取出平板，觀察菌落大小、形狀、顏色，挑取不同特征的菌落，標(biāo)記菌株號(hào)，采用三線法在新鮮的分離平板上純化。將獲得的純化菌株分別采用斜面法和甘油法保存。

1.2.2 菌株的16s DNA序列分析

1.2.2.1 16s DNA序列的PCR擴(kuò)增

取純化菌株的培養(yǎng)物，采用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板，利用16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL)：ddH2O 18.7μL、10×Taq Reaction Buffer 2.5μL、10mmol·L-1/each dNTP 0.5μL、引物各1μL、Taq DNA Polymerase 0.3μL、Temple 1μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并保存。

1.2.2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列對(duì)比分析

將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送交福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)網(wǎng)站GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行序列比對(duì)分析，選擇相關(guān)的參考菌株序列，再經(jīng)Clustal X[7]對(duì)齊后，用軟件Mega 5.0[8]進(jìn)行聚類分析(方法為Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)，構(gòu)建聚類樹(shù)[8-10]。

1.2.3 菌株脫硫效果比較

將獲得的脫硫菌菌株在分離平板上純化培養(yǎng)48h，將純化好的菌株接種到脫硫菌富集培養(yǎng)基中，并以添加無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照，30℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)48h。然后將培養(yǎng)的菌液取5%重新接入新的脫硫菌富集培養(yǎng)基中，對(duì)照組也取5%重新接入新培養(yǎng)基中，繼續(xù)做空白對(duì)照，30℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過(guò)程中依據(jù)《水質(zhì)硫化物的測(cè)定 亞甲基藍(lán)分光光度法》(HJ 1226-2021)，檢測(cè)并記錄0h、24h、48h、72h、96h的液體培養(yǎng)基的硫化物含量，并與空白對(duì)照組的硫化物含量進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算出硫化物降解率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中[11]，采用Tukey多重比較方差分析方法對(duì)不同處理的活菌數(shù)、pH和酸度進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離的結(jié)果分析

經(jīng)16s DNA測(cè)序和GenBank(http：//www.ncbi. nlm.nih.gov)序列比對(duì)分析，并以軟件NJ法(Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)，結(jié)合Bootstrap method檢驗(yàn)(檢驗(yàn)次數(shù)為1000次)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1所示。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，菌株Td51和Td-53處于同一最小分枝，緊鄰的上一節(jié)點(diǎn)與Td52 Bootstrap值達(dá)91%，再上一節(jié)點(diǎn)與硬細(xì)胞芽孢桿菌Cytobacillus firmus strain NBRC 15306(NR_112635)相同，且Bootstrap method檢驗(yàn)值為100%。菌株Td-54與枯草芽孢桿菌Bacillus stercoris strain D7XPN1(NR_181952)同處于最小分枝，且Bootstrap值達(dá)100%。菌株Td-55與硝化還原菌Nitratireductor aestuarii strain LMG 29090(NR 156984)最相似，Bootstrap值達(dá)99%。綜合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，所獲得的菌株主要是芽孢桿菌屬(Bacillus)，如表1所示。

圖1 分離菌株基于16S rDNA序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 菌株樣品序列比對(duì)結(jié)果

2.2 菌株脫硫活性測(cè)定結(jié)果

由表2可以看出，在菌株剛接入時(shí)各培養(yǎng)液的硫化物起始濃度為1.00mg·L-1，相互間無(wú)顯著差異；24h后，接菌處理組的硫化物含量略低于對(duì)照組；48h后，接菌處理組的硫化物含量顯著低于對(duì)照組。試驗(yàn)測(cè)得對(duì)照組硫化物殘留24h后為0.93mg·L-1，96h后為0.92mg·L-1，基本沒(méi)有變化。5株分離菌對(duì)硫化物96h后的降解率為34%～78%，因此，考慮菌株對(duì)硫化物去除率，菌株Td54、Td55去除率較好，可以作為下一步的研究對(duì)象。

表2 不同菌株培養(yǎng)液硫化物殘留及降解率

3 結(jié)論與討論

養(yǎng)雞發(fā)酵床墊料中存在大量的微生物，雖然大部分微生物因?yàn)榉纸怆u糞產(chǎn)生惡臭氣體，但也有部分微生物可以降解這些惡臭氣體，因此可以將這類微生物作為篩選除臭微生物的潛在菌種。

本試驗(yàn)通過(guò)富集、分離純化和16s DNA序列分析，從養(yǎng)雞發(fā)酵床墊料分離獲得5株具有脫硫功能的菌株，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)4株。目前已知的脫硫微生物有芽孢桿菌屬、短桿菌屬、硫桿菌屬等10多個(gè)種屬[12]。本文研究結(jié)果大部分屬于芽孢桿菌屬，與已報(bào)道脫硫微生物相似。劉雪純等[12]從規(guī)?；i場(chǎng)中分離篩選了2株能夠高效降解硫的菌株，分別為地衣芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌。李玥等[1]從雞糞堆肥中分離到5株具有較好除臭效果的菌株均屬于芽孢桿菌屬，分別為Bacillus sp.、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、耐寒短桿菌(Brevibacterium frigoritolerans)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、變異棒桿菌(Corynebacterium variabile)。李珊珊等[13]篩選出1株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。吳翔等[14]篩選1株原磷谷氨酸桿菌(Glutamicibacter protophormiae)。

通過(guò)水質(zhì)硫化物的檢測(cè)方法檢測(cè)液體培養(yǎng)基中硫化物含量變化，結(jié)果表明，5株脫硫菌對(duì)硫化物的去除率在34%～78%。李珊珊等[13]報(bào)道的菌株對(duì)硫化氫的去除率為52%，吳翔等[14]報(bào)道的菌株對(duì)硫化氫的降解率為62.80%，本文分離的菌株中Nitratireductor aestuarii Td-55脫硫效果最強(qiáng)，去除率為78%。

在實(shí)際生產(chǎn)中，不同的微生物菌群可能起相互協(xié)同作用，選擇不同菌株混合發(fā)酵極有可能進(jìn)一步提高脫硫降解率。周東興等[15]自蚯蚓糞中分離獲得了芽孢桿菌、黃單胞菌和假單胞菌各1株，經(jīng)組合后可使硫化氫降解率提高71.53%。因此，有必要下一步研究脫硫效果最強(qiáng)的Td-54和Td-55菌株，與其他互補(bǔ)拮抗脫硫微生物進(jìn)行菌種復(fù)配，有望進(jìn)一步提高菌株脫硫效果，提高在發(fā)酵床上的應(yīng)用潛力。