柚皮精油提取工藝及抗氧化抑菌活性研究

李 西，姜 凱，黃愛妮，王 琴，張澤英，嚴碧云*

（1.武昌工學院食品健康研究所，湖北武漢 430065；2.武漢大學人民醫(yī)院，湖北武漢 430065）

柚子（Citrus maxima）是蕓香科柑橘屬植物柚的果實，是最常食用的水果之一，2022 年中國的柚子年產量高達5.16×106t，居世界首位[1]。除了作為食用水果外，柚子通常被加工成果汁、飲料和罐頭，在食用和加工過程中會產生大量的柚子皮，約占其鮮質量的50%，如果不及時處理會腐爛，造成環(huán)境污染與資源浪費。新鮮的柚子皮營養(yǎng)豐富，含有多種功能性化合物，如果膠、膳食纖維和精油等[2-3]，具有較好的抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抑菌[4]、降壓[5]、降血糖[6]和延緩衰老[7]等功效。

植物精油是指采用壓榨、萃取、蒸餾等方法從植物的各個部位提取的具有特殊香氣和一定揮發(fā)性的油狀物質[8]。國內外關于柚皮精油的提取方法較多，如水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法、壓榨法、微波輻射法、超聲波提取法、超臨界萃取等[9-11]，不同種類柚果體積差異較大，因而柚皮精油的提取方法也有較大不同，隨著微波技術、超聲波技術在食品、化工領域的發(fā)展和應用，其高效、短時、節(jié)能的優(yōu)點受到青睞[12-13]。本研究以柚皮為原料，將微波、超聲波與有機溶劑萃取法相結合提取柚皮精油，并對其進行抗氧化和抑菌性能研究，為進一步利用柚皮精油開發(fā)生物保鮮劑、抗氧化劑等提供理論支持，也可有效解決柚皮堆積造成的資源浪費和環(huán)境污染問題，從而提高柚子的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙田柚，張家灣大市場；石油醚、NaCl、H2O2溶液、95%乙醇、FeSO4，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、DPPH，分析純，上海藍季生物試劑有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），海博生物科技有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，保存于武昌工學院微生物實驗室。

為提高xA的估計精度,也可反復將公式(11)得到的估計值作為并再次應用公式(11)獲得更精確的xA的估計。

1.2 儀器與設備

ESJ60-4 電子分析天平，上海雙旭電子有限公司；GZX-9240MBE 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BCD-218A3BR 型冰箱，美菱集團有限公司；RE-2000A 型旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；RWS-3 微波多功能實驗爐，湖南省中晟熱能科技有限公司；FS-1000T 型超聲波提取儀，上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 柚皮預處理

CT檢查：采用西門子16排CT機，層厚0.625mm，螺距0.516：1，常規(guī)掃描，觀察腰椎間盤位置及形態(tài)，測定腰椎間盤密度；除觀察椎小關節(jié)、椎體、椎弓情況外，對椎管徑線、惻隱窩情況做出評價，進一步確定病變情況。

1.3.2 柚皮精油提取

首先將預處理后的柚皮置于微波中進行加熱，冷卻后加入沸程為60～90 ℃的石油醚中[16]，置于超聲波提取儀內處理400 W、15 min，減壓過濾，濾液加入少量氯化鈉，取上層清液；最后使用旋轉蒸發(fā)儀對石油醚及柚皮精油進行分離，得到產物，按照公式（1）計算精油得率[17]。

1.3.3 單因素試驗

設置單因素基本實驗條件：微波功率450 W、微波時間8 min、超聲功率400 W、超聲時間15 min、液料比6∶1、萃取溫度40 ℃，分別改變微波功率（300、350、400、450、500 W），微波時間（4、6、8、10、12 min），液料比（1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1），萃取溫度（20、30、40、50、60 ℃）等條件，以柚皮精油得率為考察指標，進行單因素試驗。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，利用Design expert 13 設計響應面試驗，以柚皮精油得率為響應值考察柚皮精油的最佳提取工藝，Box-Behnken 試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.4 抗氧化及抑菌活性研究

參考Chen 等[18]的方法加以改進，將不同體積的柚皮精油稀釋到1%（V/V）的吐溫20 溶液中，使用高速乳液均質器充分均質，得到不同體積濃度的精油稀釋液，備用。

1.4.1 精油稀釋液的制備

1.4.2 抗氧化活性的測定

根據(jù)圖4 分析，在萃取溫度20～40 ℃柚皮精油的得率逐步上升，在40 ℃達到最大值，40 ℃后開始快速下降。低于40 ℃時，溫度的升高有利于精油物質的溶出，而高于40 ℃，其他的物質如黃酮類和多酚類等溶解性提高，雜質增多，降低精油的得率。因此，萃取溫度應控制在40 ℃左右。

（1）羥自由基清除試驗

教師要善于從學生練習的反饋中捕捉到閃光點，及時評價學生練習的結果，充分利用評價語言的魅力，鼓勵學生，使學生在品嘗到成功喜悅的同時，對學習產生濃厚的興趣，建立自信。

超微協(xié)同提取得到的柚皮精油選擇體積分數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%來測定羥自由基的清除能力，參考Zhao等[19]的測定方法進行測定，以VC 作為對照。

內浮頂儲罐主要部件有：浮盤、內浮筒、骨架、梯子、浮頂人孔、周邊密封裝置、安全通氣閥、量油孔、浮盤支腿、浮盤防轉裝置、導靜電線、雷達液位導波管導向裝置等組成。浮盤材質主要選用鋁及鋁合金、不銹鋼，浮盤與儲罐間加裝彈性密封裝置來達到對浮盤下油品、油氣的密封。浮盤在儲罐安全液位范圍內上下移動，通過浮盤下安裝的浮筒來起伏浮盤運行，同時浮盤上的安全通氣閥、支腿在浮盤下落時起到對浮盤的保護和支撐。

（2）DPPH 自由基清除試驗

4.4 強化技術指導，引導煙農安全科學合理用藥 技術人員要強化技術指導，引導煙農安全科學合理用藥。在病蟲害暴發(fā)初期，及時有效地給煙農指導農藥品種選擇及施用方法、施用最佳時間，正確的施藥部位等。通過多種宣傳培訓方式，引導煙農轉變觀念，施藥時注意用量，規(guī)范施藥行為，保護自己及環(huán)境安全。在農藥品種上盡量使用物理、生物農藥進行病蟲害的防治，在防治方法上選擇綠色防控方式。

1.4.3 抑菌活性的測定

1.認真調查摸清底數(shù)。在2016年、2017年調研摸底的基礎上，2018年，省局安排部署成立了4個專項督導小組，采取了局站領導全面負責，支部委員、科長分片包干的定點聯(lián)系責任制，深入全省9個市對26個農場的辦社會職能改革情況再次進行調查，認真梳理了各農場辦社會職能的項目、資產、債務、機構人員及經(jīng)費開支等情況，初步明確了農場辦社會職能的改革方式，切實做到底數(shù)清楚、界限分明、權責清晰、任務明確。

剝離沙田柚果皮表皮，切成1 cm×1 cm×1 cm 的方塊[14-15]，取100 g 置于燒杯中，濾紙封口備用。

（1）菌液的制備

參考Friedman 等[21]與Carso 等[22]描述方法并適當修改。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌活化后，分別在平板上劃線，挑取單菌落到1 mL TSB 中，37 ℃、200 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。稀釋涂布，收集106CFU/mL 菌懸液備用。

（2）抑菌活性的測定

參考Kim 等[23]的方法，分別對菌種的抑菌活性進行測定。

(1)大學生對網(wǎng)絡借貸平臺的認知。在被調查對象中，有64.58%的大學生使用過網(wǎng)絡借貸平臺。在對網(wǎng)絡借貸平臺的態(tài)度方面，18.75%的大學生認為從網(wǎng)貸平臺借貸是一種值得提倡的消費方式，27.08%的大學生則表示反對，54.17%的大學生持中立態(tài)度。這表明，大學生對網(wǎng)絡借貸平臺的認可度適中。在沒有使用過網(wǎng)絡借貸平臺的大學生中，不使用網(wǎng)絡借貸平臺的主要原因是能夠保持收支平衡。這說明，大學生對網(wǎng)絡借貸平臺的使用與日常收支情況聯(lián)系緊密。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro 2021 進行圖形繪制，SPSS 25 進行單因素方差分析，Design-Except 13 進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對柚皮精油得率的影響

由圖1 可知，隨著微波功率的增加，柚皮精油得率先升高后降低。當微波功率在450 W 時，柚皮精油得率最高，為7.9%。微波功率在200～400 W 時，得率穩(wěn)步上升；在400～450 W 時，得率迅速上升，可能是由于被加熱的水分子沖破了柚皮細胞壁，使細胞內的有效物質得以析出。因此，微波功率選擇450 W。

通過實踐，發(fā)現(xiàn)在語言教學中留白藝術的運用，能有效的促進幼兒的發(fā)展。我們將繼續(xù)研究探索語言教學中留白藝術的運用，并力求做到“留白”不“空白”，讓幼兒在語言領域中主動探索、主動交流、主動學習，收到“此處無聲勝有聲”的藝術效果。

圖1 微波功率對柚皮精油得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.2 微波時間對柚皮精油得率的影響

在單因素試驗結果的基礎上，選取微波功率、微波時間、液料比、萃取溫度4 個因素，以柚皮精油的得率為響應值進行Box-Behnken 試驗設計，結果見表2。

圖2 微波時間對柚皮精油得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.3 液料比對柚皮精油得率的影響

超微協(xié)同提取得到的柚皮精油選擇體積分數(shù)為2%、4%、6%、8%、10%來測定DPPH 自由基的清除能力，參考Dumore 等[20]的測定方法進行測定，以VC 作為對照。

由圖3 可知，石油醚并不是越多越好，在1∶1 到6∶1 范圍內得率穩(wěn)步上升；在6∶1 時達到最大值，然后迅速下降?？赡苁且驗檩腿≡噭┡c柚皮里有效物質的溶解在6∶1 時達到飽和，再增加石油醚得率不增加，但是在分離時石油醚可以帶走更多的柚皮精油，導致在6∶1后的得率降低。因此，選擇液料比6∶1 為宜。

圖3 液料比對柚皮精油得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of essential oil from pomelo peel

2.1.4 萃取溫度對柚皮精油得率的影響

4、走農業(yè)保險與農業(yè)防災救災相結合發(fā)展之路。農業(yè)保險部門要積極與氣象、農業(yè)等部門溝通，針對各縣市區(qū)農業(yè)生產布局和不同農作物的生長發(fā)育階段，在重大氣象災害前后，派出專家走進田間地頭，指導農民進行防災、減災和救災工作，將農業(yè)保險向農業(yè)防災、受災增產等方面延伸，積極為農業(yè)經(jīng)營主體開展防災減災服務，通過防災減災與保險救濟，幫助減少農民災害損失，促進災后盡快恢復生產，推進農業(yè)保險穩(wěn)步健康持續(xù)發(fā)展。

圖4 萃取溫度對柚皮精油得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of essential oil from pomelo peel

2.2 Box-Behnken 試驗結果與分析

由圖2 可知，微波時間在4～8 min 時，隨著微波作用時間的增加，柚皮精油得率也逐步上升，當微波時間大于8 min，柚皮精油得率迅速下降。可能是由于前期為微波作用的升溫階段，在8 min 左右達到最適合的溫度，8 min 后則柚皮溫度過高，導致柚皮精油汽化。因此微波時間在8 min 左右為宜。

表2 Box-Behnken 試驗設計結果Table 2 Results of Box-Behnken test design for proportion optimization

依據(jù)表2 中Box-Behnken 的試驗結果，使用Design Expert 軟件處理得到柚皮精油得率與各個因素之間的多元回歸方程：Y=7.97+0.2833A+0.2436B-0.1863C-0.1906D-0.075 0AB+0.025 0AC-0.100 0AD-0.019 2BC+0.125 0BD-0.003 1CD-1.810 0A2-1.250 0B2-0.584 2C2-0.293 8D2。其決定系數(shù)R2=0.993 8，表明根據(jù)試驗結果建立的數(shù)學模型對柚皮精油得率的相關度非常高。為了驗證方程的可靠性，進一步進行了回歸模型方差分析。

徐浡君的風景油畫作品以云南石林縣圭山、昆明長蟲山的石林風景，卡斯特地貌為描繪對象，著力打造這些較為原始的土著風光，其深層目的在于這些未被開發(fā)的地區(qū)，較少受到所謂現(xiàn)代文明的侵擾，具有一種大樸為美，大美為真的藝術理念。

由表3 分析得到，回歸模型F值為136.44、P＜0.000 1、失擬項P＞0.05 不顯著、校正決定系數(shù)說明數(shù)學模型顯著，98.79%的柚皮精油的得率可使用該模型分析。A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對得率的影響極其顯著（P＜0.000 1），BD 對得率的影響顯著（P＜0.05）。說明得率與各個因素之間有明顯的二次拋物關系，依據(jù)各個單因素的F值，可以得到各個因素對柚皮精油得率的影響依次為微波功率＞微波時間＞液料比＞萃取溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

微波功率（A）、微波時間（B）、液料比（C）、萃取溫度（D）對精油得率兩兩交互影響如圖5，圖中AB、AC、BD曲面較為陡峭，但AB、AC 曲面圖中等高線圖橢圓不如BD 明顯，故BD 交互顯著性明顯。通過多元回歸方程計算，得到最佳柚皮精油提取工藝為微波功率450 W、微波時間8 min、液料比6∶1（mL/g）、萃取溫度36.8 ℃。在此工藝條件下經(jīng)過5 次驗證得到得率為（8.0±0.33）%，與預測值8.034%極接近，表明響應面模型模擬結論具有可行性，與實際情況極為接近。

但10月原油創(chuàng)出階段新高后拐頭直下，不到4個月時間又暴跌了40%，而此次市場形成共識的驅動因素有四個，一是沙特、俄羅斯產量持續(xù)創(chuàng)新高，市場擔憂OPEC減產協(xié)議實際效果削弱，二是美國原油產量持續(xù)增加，加重全球供過于求局面，三是美國經(jīng)濟增長周期見頂以及川普發(fā)動的貿易保護可能令全球經(jīng)濟放緩，未來幾年原油需求放緩。四是美聯(lián)儲處于加息周期中，原油屬于風險資產，資金有出清避險需求。

圖5 交互影響得率的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of factors affecting yield

2.3 柚皮精油的抗氧化性

2.3.1 柚皮精油對羥自由基的清除率

由圖6 可知，柚皮精油與VC 隨著濃度的增加對羥自由基清除率均有增加，其中柚皮精油對羥自由基清除率上升最為明顯；在體積分數(shù)為10%時兩者無明顯差異，對羥自由基清除率均達到95%以上，其中精油清除率為98.29%。因此柚皮精油體積分數(shù)為10%時，對羥自由基的清除率效果顯著。

圖6 柚皮精油對羥自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of essential oil from pomelo peel

2.3.2 柚皮精油對DPPH 自由基的清除率

由圖7 可知，兩者對DPPH 自由基清除率的曲線幾近平行上升，在最大試驗濃度10%時，VC 的清除率接近70%，柚皮精油的清除率為49.28%，說明柚皮精油還原性較VC 弱，依據(jù)曲線趨勢需繼續(xù)增加濃度。

圖7 柚皮精油對DPPH 的清除率Fig.7 DPPH scavenging rates of essential oil from pomelo peel

2.4 柚皮精油的抑菌活性

由表4 可知，用1%（V/V）的吐溫20 溶液作為對照組，隨著精油濃度的增加，抑菌效果不斷增強，在試驗最大濃度10%（V/V）時，精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用最強，金黃色葡萄球菌此時的濃度為（5.92±0.11）log CFU/mL、大腸桿菌濃度為（6.08±0.09）log CFU/mL，分別比空白低3.13log CFU/mL 和2.90log CFU/mL。結果表明，柚皮精油對金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌，這與柑橘精油的文獻結果一致[24-25]，說明精油及其化合物對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌的抑制作用。

表4 不同濃度柚皮精油對革蘭氏菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of essential oils from pomelo peel with different concentrations on gram-positive bacteria

3 結論

本試驗以柚皮為原料，采用微波超聲協(xié)同的提取方法，利用單因素聯(lián)合響應面對提取工藝進行了優(yōu)化，得到柚皮精油提取的最佳工藝參數(shù)為微波處理功率450 W、微波處理時間8 min、超聲功率400 W、超聲時間15 min、石油醚與柚皮的比例6∶1（mL/g）、萃取溫度36.8 ℃，此條件得率為（8.0±0.33）%，制得的精油為澄清的金黃色透明液體，具有柚子清香。

在混凝土制備過程中，最為關鍵的問題是配合比的確定。目前大多數(shù)的工程項目使用預拌混凝土，在混凝土制備過程中，由混凝土攪拌站的試驗室來提供準確的配比。而對一些需要現(xiàn)場攪拌混凝土的工程項目，混凝土原材料配比的確定相對困難一些，要充分考慮水泥特性、砂石級配、含水率等因素。只有選擇合理的配比，才能保證混凝土的強度以及工作性。

精油體積分數(shù)為10%時，對羥自由基清除率達到了98.29%，DPPH 自由基的清除率則為49.28%。在精油體積分數(shù)為10%時，金黃色葡萄球菌比空白低3.13log CFU/mL、大腸桿菌比空白低2.90log CFU/mL。此方法提取的柚皮精油有較優(yōu)秀的抑菌活性和一定的抗氧化活性，可應用于食品保鮮。