復(fù)合酶-超聲波輔助提取火龍果花黃酮及抗氧化性研究

張中華，徐西俊，陳鳳真*，阮 帝，李 霞，何 盈

（1.菏澤市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東菏澤 274000；2.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東菏澤 274000）

火龍果（Hylocereus undatusBritt）是仙人掌科植物[1]?；瘕埞慷浠ㄙ|(zhì)量達(dá)600～800 g，因此被稱為“大花王”[2]?；瘕埞ǜ缓瑺I養(yǎng)元素和生物活性成分，具有抑菌、消炎、清火、潤肺、止咳、增強(qiáng)免疫力、降血糖、治療高尿酸癥等作用[3-4]；其所含的黃酮具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、降血脂及預(yù)防動脈粥樣硬化等生物活性[8-9]。目前，火龍果花在我國的主要利用方式是食用，食用人群主要集中在南方地區(qū)，北方地區(qū)很少有人食用。近年我國北方逐漸擴(kuò)增火龍果種植面積，產(chǎn)生大量的火龍果花，被疏掉的花朵極少一部分被食用，大部分被作為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物丟棄，造成資源浪費(fèi)。目前關(guān)于火龍果花黃酮的研究不多。李國勝等[10-11]以乙醇為溶劑，采用正交試驗(yàn)建立了火龍果花的提取工藝條件，測定黃酮含量為2.787 mg/g，研究結(jié)果表明火龍果花具有較強(qiáng)的抗氧化性。羅小艷等[12]建立了黃酮的最佳提取條件，提取的火龍果花中黃酮含量為0.747%。單一乙醇提取法提取率較低，超聲波輔助提取具有提取效率高、能耗低、保護(hù)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[13]。酶輔助超聲波提取結(jié)合超聲波法和酶法的優(yōu)點(diǎn)可以縮短提取時間、提高提取效率，條件溫和，節(jié)約能源。

本文以火龍果花為研究對象，采用復(fù)合酶-超聲輔助提取，對影響黃酮提取率的因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)分析，然后利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)對單因素進(jìn)行顯著分析，對影響顯著的因素采用響應(yīng)面法優(yōu)化火龍果花黃酮提取工藝。最后通過對ABTS+·、超氧陰離子清除能力評價黃酮的體外抗氧化活性，以期為火龍果花的綜合利用提供理論依據(jù)，提高火龍果花附加值，促進(jìn)火龍果花黃酮在功能性食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

將市場購買的干燥紅皮白肉品種火龍果花粉碎，過80 目篩，在通風(fēng)處用石油醚進(jìn)行脫脂處理12 h，回收石油醚，抽濾，烘干。

1.2 試劑

2,2- 聯(lián)氮- 二(3- 乙基- 苯并噻唑-6- 磺酸)二銨鹽2,2’-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)ammonium salt，ABTS，純度98%、纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（50 U/mg），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（京壇墨-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)檢中心），其它所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 火龍果花黃酮的提取與含量測定

精確稱量經(jīng)預(yù)處理的火龍果花粉末，加入乙醇提取液與酶液，超聲輔助提取，5 500 r/min 離心8 min 后，取上清液1 mL，然后加入樣品溶液用于測試。所有實(shí)驗(yàn)處理均為重復(fù)3 次。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定火龍果花中的黃酮含量[14]。配制濃度梯度為80～200 μg/mL 的蘆丁溶液，在510 nm 處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=0.007X-0.002 3，R2=0.998 7，回歸方程可用。黃酮提取率計(jì)算公式見式（1）。

式中，c為提取液黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為測定時反應(yīng)體系的體積，mL；V1為提取液的體積，mL；V3為測定時吸取的體積，mL；m為稱取的樣品的質(zhì)量，mg。

1.4 單因素試驗(yàn)

固定纖維素酶∶果膠酶酶比為2∶1，加酶量2 000 U/g，pH 值5，超聲溫度30 ℃，超聲時間40 min，依次以乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL/g）、酶解時間（30、60、90、120、150 min）、酶解溫度（45、50、55、60、65℃）與超聲功率（150、180、210、240、270 W）為變量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定的上一個因素最佳工藝條件固定不變，其它條件不變。

1.5 篩選試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，從液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時間、酶解溫度、超聲功率共5 個因素中篩選出對提取率影響顯著的因素。以黃酮提取得率為評價指標(biāo)，然后對影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.6 抗氧化性測定

ABTS＋·的測定：參考王思溥等[15]和Zhou 等[16]方法。

超氧陰離子的測定：參照郭雪峰等[17]和Marklund等[18]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與作圖使用Excel 2010 軟件；單因素顯著性采用SPSS 21 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；方差分析與響應(yīng)面繪圖分別采用Design-Expert 12 和Origin 2018 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

由圖1 中可以得到，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮得率先上升后下降再上升，當(dāng)達(dá)到70%時，得率達(dá)到最大為9.41%；較低或較高的乙醇體積分?jǐn)?shù)，其極性均不利于黃酮的溶出，此外高濃度的乙醇還會加大其他醇溶性物質(zhì)的溶出，對火龍果花黃酮產(chǎn)生競爭性抑制溶出從而影響黃酮類化合物的提取率[14]。因此，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.2 液料比對黃酮提取得率的影響

從圖2 中可知，隨著液料比的增大，黃酮提取得率增加；由于提取體積小，酶與底物未能充分接觸，使一部分樣品未能完全浸出，因此提取率較低[14]，適當(dāng)?shù)囊毫媳忍岣吡嘶瘕埞S酮的提取得率。當(dāng)液料比為50∶1（mL/g）與40∶1（mL/g）時，黃酮提取得率差異不顯著；考慮到降低提取成本和對環(huán)境的污染，因此選擇最佳提取液料比為40∶1（mL/g）。

圖2 液料比對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.3 酶解時間對黃酮提取得率的影響

由圖3 可知，黃酮提取得率隨酶解時間延長先升高后下降，酶解90 min 時，黃酮提取得率最高，為8.04%；這可能由于酶解底物溶出需要一定時間，時間短，黃酮溶出不徹底，提取率較低；當(dāng)酶解超過90 min 后，雜質(zhì)溶出也增多，雜質(zhì)可能與黃酮發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致提取率下降。因此最佳酶解時間為90 min。

2.1.4 酶解溫度對黃酮提取得率的影響

如圖4（見下頁）所示，火龍果花黃酮提取得率隨著酶解溫度的升高先上升后下降。50 ℃的提取得率顯著高于其它處理，這可能是由于酶解溫度為50 ℃時，復(fù)合酶的活性最高，使黃酮高效地游離在溶液中；酶解溫度進(jìn)一步上升會使酶活性降低或部分失活，導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此確定最佳酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.5 超聲功率對黃酮提取得率的影響

圖5 顯示，隨著超聲波功率的增大，火龍果花黃酮的提取得率先升高后下降。超聲波功率較低時，超聲波空化產(chǎn)生的壓力小，細(xì)胞破碎不完全，黃酮提取得率較低；隨著超聲波功率的增大，由細(xì)胞液中的空化作用而產(chǎn)生更多的空化泡，使破碎作用增強(qiáng)，黃酮提取得率增加[14]。當(dāng)超聲功率超過240 W 時，可能用于功率太大，破壞了黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取得率下降。因此，超聲波輸出功率在240 W 時提取效果最佳。

圖5 超聲功率對火龍果花黃酮提取得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of total flavonoids from pitaya flower

2.2 Plackett-Burman 篩選試驗(yàn)結(jié)果

由表2、3 可知，模型P＜0.01，說明模型極顯著，模型可以反映黃酮得率隨各因素的變化情況；模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.951 7，說明方程的擬合度極好，能真實(shí)地反映四個變量與黃酮提取得率的關(guān)系；R2Adj（調(diào)整確定系數(shù)）為0.911 5，說明該方程能解釋91.15%響應(yīng)值的變化，R2pre為0.807 0，反映了預(yù)測值與實(shí)際值有較高的相關(guān)性。乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間對火龍果花黃酮提取率達(dá)到極顯著影響，液料比達(dá)到顯著影響，其它因素影響不顯著。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時間與液料比這三個顯著或極顯著因素作為響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的變量，設(shè)定酶解溫度為50℃、超聲功率為240W。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Test design of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析Table 3 Analysis of variance of Plackett-Burman test design

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化火龍果花黃酮的提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間作為響應(yīng)變量，以黃酮提取率作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行分析，建立二次回歸多元方程為Y=-6.882 5+0.74492A-0.16222B+0.13903C+0.00045AB-0.002775AC+0.001 191 67BC-0.006 31A2+ 0.000 64B2-0.000 80C2。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of response surface test

由表5 中可看出，模型回歸極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型是有效的，可以很好地分析數(shù)據(jù)；該模型R2=0.979 3，R2Adj=0.952 6，說明模型擬合程度高，能擬合97.9%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，較好地反映各因素與提取率之間的關(guān)系；可以用此模型來確定火龍果花黃酮的最佳提取工藝條件。三個因素的一次項(xiàng)均達(dá)到了顯著或極顯著水平，說明三個因素對黃酮提取率影響顯著，線性效應(yīng)明顯；液料比與酶解時間的二次項(xiàng)對黃酮提取率極顯著（P＜0.01），說明對黃酮提取得率影響較大；從F值可以看出，對黃酮提取率影響最大的是酶解時間，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表5 Box-Behnken 方差分析表Table 5 Box-Behnken analysis of variance

2.3.2 響應(yīng)面各因素間的交互分析

從圖6（見下頁）中可看出，火龍果花黃酮提取率隨液料比的增大先升高后下降，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；乙醇提取分?jǐn)?shù)的曲面坡度較液料比的曲面陡，即乙醇濃度曲面傾斜度高，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響大于液料比；等高線為橢圓形，說明液料比和酶解時間交互作用較強(qiáng)；隨酶解時間的延長與液料比的增大，火龍果花黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢；液料比曲面坡度較酶解時間的曲面平緩，說明液料比對黃酮提取率的影響小于酶解時間，這與方差結(jié)果一致?；瘕埞S酮提取率隨酶解時間的延長先升高后下降，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高；酶解時間曲面傾斜度高，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響小于酶解時間。

圖6 不同因素交互作用對黃酮提取得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graphs of the interactive effects from different factors on the yield of flavonoids

2.3.3 最佳工藝條件

通過Design-Expert 12 軟件的響應(yīng)面優(yōu)化得到火龍果花黃酮提取率的理論值最大為10.36%，最佳條件為液料比48.07∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.99%、提取時間62.84min。為便于實(shí)際操作，調(diào)整液料比48∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶解時間63 min。依照此工藝條件進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，得到火龍果花黃酮的提取率為10.28%，與預(yù)測值接近，說明Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法得到的提取條件可靠，可用來預(yù)測火龍果花黃酮的提取得率。在此條件下黃酮提取率高于李國勝等[10]和羅小艷等[12]研究結(jié)果，說明復(fù)合酶-超聲波輔助提取方法比上述方法的黃酮提取率高。

2.4 火龍果花黃酮抗氧化活性測定

由圖7 可知，火龍果花黃酮提取液和VC 溶液對ABTS＋·清除率變化一致，隨著質(zhì)量濃度的增加，對自由基清除率上升；在黃酮提取液濃度為1.2 mg/mL 時，對ABTS＋·清除率為45.65%；說明火龍果花黃酮能提供較多的活性氧，從而更多的ABTS＋·被清除[19-21]。在同一質(zhì)量濃度下，VC 溶液對這兩種自由基的清除能力高于火龍果花黃酮提取液，說明火龍果花黃酮提取液具有一定的抗氧化性，但比VC 抗氧化性弱。

圖7 火龍果花黃酮對ABTS＋·的清除率Fig.7 ABTS＋·scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

超氧陰離子可以使細(xì)胞的膜相系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，生成其他氧自由基，從而損傷機(jī)體引起疾病[19]。由圖8可知，火龍果花黃酮提取液和VC 溶液對超氧陰離子的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高；火龍果花黃酮提取液在0.15～1.20 mg/mL 時，其清除率從21.67%上升到39.67%；火龍果花黃酮提取液對超氧陰離子的清除率低于同一質(zhì)量濃度VC 溶液的。

圖8 火龍果花黃酮對超氧陰離子的清除率Fig.8 Superoxide anion scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

3 結(jié)論

本研究建立了復(fù)合酶-超聲波輔助提取火龍果花黃酮的方法。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出對火龍果花黃酮提取率影響顯著的三個因素為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間。通過響應(yīng)面優(yōu)化得到火龍果花黃酮提取的最佳條件為液料比48∶1（mL/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶解時間63 min，在此優(yōu)化條件下黃酮提取率為10.28%；火龍果花黃酮有較好的抗氧化作用，可以作為食品、日化品與藥品的原料，為提升火龍果花制品的附加值提供更多途徑，合理利用果品廢棄物，使之變廢為寶，延長產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)火龍果產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。