miRNA-181a、胱天蛋白酶富集域家族成員11、核因子κB在彌漫大B 細胞淋巴瘤患者中的表達及臨床意義△

陳青，郭廣秀，王建

贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000

彌漫大B 細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的亞型，在生物學、遺傳學、形態(tài)學等方面均具有高度異質(zhì)性[1-2]。臨床多采用利妥昔單抗聯(lián)合環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松（CHOP）方案治療彌漫大B 細胞淋巴瘤，60%～70%的患者可治愈，但仍有部分患者對治療的反應較差，且易復發(fā)或進展[3-4]。研究表明，彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)病與體內(nèi)微小RNA（microRNA，miRNA）的表達密切相關，miRNA-181a 可抑制細胞分化過程中關鍵基因的表達，從而抑制B 淋巴細胞惡性轉(zhuǎn)化，可能參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。胱天蛋白酶富集域家族成員11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）可介導獲得性免疫反應，增強核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，誘發(fā)細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導等，對彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進作用[7-8]。有關研究已證實CARD11 在彌漫大B 細胞淋巴瘤淋巴結(jié)組織中表達，且是患者遠期生存的獨立影響因素[9]。明確miRNA-181a、CARD11 與彌漫大B 細胞淋巴瘤病情進展的關系對及時采取針對性干預治療至關重要，基于此，本研究探討miRNA-181a、CARD11、NF-κB在彌漫大B 細胞淋巴瘤患者中的表達及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年7 月至2020 年6 月于贛州市人民醫(yī)院就診的彌漫大B 細胞淋巴瘤患者。納入標準：①經(jīng)影像學和病理學檢查首次確診為彌漫大B 細胞淋巴瘤；②可耐受利妥昔單抗聯(lián)合CHOP 治療方案，一線治療至少接受6 個周期的標準治療方案；③年齡為25～73 歲；④臨床資料完整。排除標準：①惰性淋巴瘤轉(zhuǎn)化為彌漫大B 細胞淋巴瘤；②合并其他惡性腫瘤；③合并嚴重肝、腎功能異常。依據(jù)納入和排除標準，本研究納入85 例彌漫大B 細胞淋巴瘤患者作為觀察組，男48 例，女37 例；年齡25～73 歲，平均（64.56±8.01）歲。另選取同期贛州市人民醫(yī)院收治的60 例增生性淋巴結(jié)炎患者作為對照組，男35 例，女25 例；年齡28～69 歲，平均（65.03±7.86）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）檢測miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量

采集兩組患者治療前的淋巴結(jié)組織，切開并應用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水及切片，應用總RNA提取試劑提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），應用PCR 儀進行PCR 擴增。PCR 條件：95 ℃5min，95 ℃10 s，60 ℃20 s，共50 個循環(huán)；95 ℃10 s，60 ℃10 s，40 ℃30 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對表達量。GAPDH上游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3'，下游引物5'-GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG-3'；miRNA-181a 上游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC3'，下游引物5'- ACACTCCAGCTTCACCATTCAACGCTGTCG-3'；CARD11上游引物5'-CAGAGGAGCTGCGAGACAA-3'，下游引物5'-GGTGCTTGTACATTTCACAGTCC-3'；NF-κB上游引物5'-GGCGTGTATAAGGGGCTATAA-3'，下游引物5'-TTTTCCCGATCTCCCAGCTC-3'。

1.3 資料收集

收集彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的臨床資料，包括性別、年齡、淋巴瘤結(jié)外累及數(shù)目、臨床分期、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、國際預后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分[10]。臨床分期按照Ann Arbor-Cotswolds 分期標準[11]進行評估。

1.4 療效評價標準

根據(jù)實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）[12]評價兩組患者的臨床療效。完全緩解（complete response，CR）：腫瘤病灶完全消失，至少持續(xù)1 個月；部分緩解（partial response，PR）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比減少≥30%，至少持續(xù)1 個月；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比減少＜30%或增加＜20%；疾病進展（progressive disease，PD）：腫瘤病灶長徑總和與基線相比增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，3 組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）分析miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值及對療效的預測價值；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

不同性別、年齡、血清LDH 水平、結(jié)外累及數(shù)目彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a 相對表達量分別明顯高于Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2分的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.644、3.343，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CARD11mRNA 相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；結(jié)外累及數(shù)目＞1 個、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者CARD11mRNA相對表達量分別明顯高于結(jié)外累及數(shù)目≤1 個、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.064、8.461、7.537，P＜0.01）。不同性別、年齡、血清LDH 水平彌漫大B 細胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；結(jié)外累及數(shù)目＞1 個、Ann Arbor 分期為Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者NF-κBmRNA 相對表達量分別明顯高于結(jié)外累及數(shù)目≤1 個、Ann Arbor 分期為Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=3.057、11.967、2.394，P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

2.2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于對照組，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較（±s）

表2 觀察組和對照組患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與Ⅰ～Ⅱ期比較，P＜0.05

組別觀察組Ⅰ～Ⅱ期（n=41）Ⅲ～Ⅳ期（n=44）對照組（n=60）F值P值miRNA-181a CARD11 mRNA NF-κB mRNA 1.21±0.24a 1.62±0.32ab 0.56±0.11 284.308＜0.01 0.92±0.13a 1.21±0.18ab 0.48±0.07 422.493＜0.01 1.25±0.21a 1.86±0.26ab 0.66±0.11 484.608＜0.01

2.3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA 相對表達量的比較

療效為CR/PR/SD 彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均低于療效為PD 的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對表達量的比較（±s）

表3 不同療效彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11 mRNA、NF-κB mRNA相對表達量的比較（±s）

療效CR/PR/SD（n=65）PD（n=20）t值P值miRNA-181a 1.34±0.21 1.68±0.26 5.978＜0.01 CARD11 mRNA 1.04±0.19 1.17±0.20 2.643＜0.05 NF-κB mRNA 1.49±0.28 1.84±0.26 4.967＜0.01

2.4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測診斷彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.852、0.841、0.830。（表4、圖1）

圖1 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯(lián)合檢測診斷彌漫大B細胞淋巴瘤患者臨床分期的ROC曲線

表4 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值

2.5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的預測價值

ROC 曲線顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測預測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.847、0.684、0.816。（表5、圖2）

圖2 miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯(lián)合檢測預測彌漫大B細胞淋巴瘤患者療效的ROC曲線

表5 miRNA-181a、CARD11、NF-κB 單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的預測價值

3 討論

彌漫大B 細胞淋巴瘤的異質(zhì)性較強，標準治療具有較好的治療效果，然而其治療方式單一，仍有許多患者治療失敗，導致預后較差，隨著病情進展可累及組織或器官，導致腫瘤浸潤、腫塊壓迫及出血等[13-14]。臨床上常采用IPI 評分評估彌漫大B 細胞淋巴瘤病情危險程度，然而其評估價值具有一定的局限性[15]。因此，預測腫瘤的發(fā)展情況并及時給予相應的治療，對于提高患者生存率具有重要意義。既往研究顯示，miRNA 可通過調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、凋亡等過程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miRNA-181a 是T 淋巴細胞的敏感性和選擇性調(diào)節(jié)器[16]。CARD11 與腫瘤進展和細胞侵襲密切相關，主要通過NF-κB 影響細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導等[17-18]，但關于二者與彌漫大B 細胞淋巴瘤病情進展的關系尚未見報道。

本研究比較對照組與觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量，結(jié)果顯示，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期觀察組患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于對照組，且Ⅲ～Ⅳ期、IPI 評分為3～5 分彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期、IPI 評分為0～2 分的患者。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，且隨著病情進展，其表達水平升高。這可能是因為，miRNA-181a 可通過調(diào)控下游靶基因的表達參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展，還可通過抑制CARD11 的表達抑制腫瘤生長。CARD11 是一種支架蛋白，可介導獲得性免疫反應，調(diào)節(jié)細胞膜和細胞骨架之間的相互作用。高表達的CARD11 可激活NF-κB 上游信號分子，導致NF-κB表達升高，抑制T 細胞增殖，從而誘導其凋亡。

本研究比較不同臨床分期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量，結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期彌漫大B 細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB表達水平與彌漫大B 細胞淋巴瘤患者病情進展有關，病情越嚴重，其表達水平越高。分析原因如下：miRNA-181a 在組織分化、細胞增殖和凋亡過程中扮演了重要角色，可通過調(diào)控多種抑癌基因和原癌基因的表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程進行調(diào)控[19]。CARD11 在T 和B 細胞誘導的NF-κB 活化過程中發(fā)揮了關鍵作用，可增強組成型NF-κB 的活性，促進NF-κB 活性相關抗原受體表達，從而參與彌漫大B 細胞淋巴瘤的發(fā)展過程[20]。NF-κB 是一種從B 細胞的細胞核中提取出來的可與免疫球蛋白κ鏈基因特異性結(jié)合的核蛋白因子，家族中每個成員N 末端均含有兩種類似免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域[21-22]；NF-κB 廣泛存在于各種類型的細胞中，當機體受到疾病侵襲時，被激活的NF-κB 參與多種細胞因子（如黏附因子、轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子等）對刺激的反應，從而促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移，還可促進腫瘤新生血管生成及耐藥，當彌漫大B 細胞淋巴瘤患者疾病進展時，其表達水平隨之升高，與相關研究報道的結(jié)果一致[23-24]。本研究結(jié)果還顯示，療效為CR/PR/SD彌漫大B細胞淋巴瘤患者miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 相對表達量均低于療效為PD 的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示通過監(jiān)測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者的miRNA-181a、CARD11mRNA、NF-κBmRNA 水平可對治療效果進行判斷，miRNA-181a、CARD11、NF-κB高表達可能反映患者預后較差。本研究采用ROC 曲線評估m(xù)iRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的診斷價值，結(jié)果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測診斷彌漫大B 細胞淋巴瘤患者臨床分期的AUC 為0.968，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.852、0.841、0.830。采用ROC 曲線評估m(xù)iRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨及聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤患者預后的預測價值，結(jié)果顯示，miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測預測彌漫大B 細胞淋巴瘤患者療效的AUC 為0.953，高于miRNA-181a、CARD11、NF-κB單獨檢測的0.847、0.684、0.816。表明miRNA-181a、CARD11、NF-κB聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤的診斷價值較高，對預后的預測價值較高。

綜上所述，miRNA-181a、CARD11、NF-κB可作為彌漫大B 細胞淋巴瘤患者病情監(jiān)測和預后預測指標，其表達水平升高提示患者病情可能加重，三者聯(lián)合檢測對彌漫大B 細胞淋巴瘤的診斷價值較高，且對預后的預測價值較高。