飼糧中添加不同乳酸菌對籽鵝腸道菌群、形態(tài)結(jié)構(gòu)、pH及免疫器官指數(shù)的影響

■ 白長勝 尹珺伊 王 歡 王 巖 田秋豐 劉秋瑾 孟維珊 趙金波

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江省飼用中草藥發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江省獸用藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005）

隨著現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化程度的迅速提高，由于抗生素或化學(xué)藥物的無節(jié)制使用導(dǎo)致的藥物殘留、動物源細(xì)菌耐藥和環(huán)境污染等問題日益凸顯，對畜禽產(chǎn)品質(zhì)量、公共衛(wèi)生安全及生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害[1-2]。從1986 年瑞典在豬飼料中禁抗開始，世界多國相繼頒布并實(shí)施了禁止或限制抗生素或化學(xué)藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)使用的相關(guān)法規(guī)，我國也在2015 年和2018 年陸續(xù)出臺了禁抗的相關(guān)規(guī)定，由此可見，減少或禁止抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中使用已成為必然趨勢。但是，在新的養(yǎng)殖形勢下，極可能對養(yǎng)殖水平造成不利影響，因此，開發(fā)安全、高效及低成本的產(chǎn)品替代抗生素的應(yīng)用成為現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的核心和關(guān)鍵[3-4]。

乳酸菌是動物腸道內(nèi)定植的主要微生物，具有維持腸道菌群平衡、提高腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等有益生理特性[5-7]，是抗生素或化學(xué)藥物的有效替代品之一。乳酸菌具有無毒副作用、綠色環(huán)保和安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，是我國允許使用的微生物類飼料添加劑，已廣泛應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖過程中。目前對乳酸菌的應(yīng)用研究更多的是豬、牛和羊等動物生產(chǎn)，在鵝生產(chǎn)上應(yīng)用研究相對較少。生產(chǎn)上往往將適用于家畜的乳酸菌直接應(yīng)用于鵝的生產(chǎn)中，而鵝的生理特點(diǎn)與家畜區(qū)別較大，因此飼喂效果并不顯著。王利紅[8]從肉雞消化道中分離篩選乳酸菌可以提高肉雞生產(chǎn)性能，馮會賢等[9]從雞腸道中分離乳酸菌具有較強(qiáng)的抑制致病性大腸桿菌的活性。本研究將前期分離篩選到的乳酸菌與市售乳酸菌同時飼喂籽鵝，旨在通過飼養(yǎng)試驗(yàn)研究不同乳酸菌對籽鵝腸道菌群、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道pH 及免疫器官指數(shù)的影響，篩選到更適合家禽生產(chǎn)的乳酸菌。在我國養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的時代背景下，為提高家禽養(yǎng)殖水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為市購普通乳酸菌；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）為自主篩選乳酸菌，分離自酸菜湯，保存于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院微生物實(shí)驗(yàn)室。2種乳酸菌的生物學(xué)特性見表1。

表1 乳酸菌生物學(xué)特性

1.1.2 試驗(yàn)動物

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院選育的純種籽鵝。

1.1.3 基礎(chǔ)飼糧

購自齊齊哈爾某飼料廠，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用28 日齡健康，體重（[875.23±33.18） g]相近的籽鵝90 只，隨機(jī)分為3 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只，公母各半。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加植物乳桿菌109CFU/kg（試驗(yàn)組I）、乳酸片球菌109CFU/kg（試驗(yàn)組Ⅱ），試驗(yàn)期28 d。乳酸菌活化后接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，按設(shè)計(jì)量添加到飼糧中拌勻。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前對鵝舍和器具全面消毒，網(wǎng)床平養(yǎng)，每個重復(fù)籽鵝置于一欄。試驗(yàn)鵝自由采食、飲水。在整個試驗(yàn)期間避免使用任何抗生素及添加劑。按照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，其他飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行，試驗(yàn)期間詳細(xì)記錄各組試驗(yàn)籽鵝的健康狀況。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 腸道菌群

試驗(yàn)結(jié)束時，從每個重復(fù)中選取2 只體重與平均體重接近的試驗(yàn)籽鵝（禁食12 h，自由飲水），屠宰，在無菌環(huán)境中準(zhǔn)確稱取1 g 盲腸內(nèi)容物，加入滅菌的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定腸道內(nèi)容物中乳酸菌、大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量[10]，菌群數(shù)量以1 g 腸道內(nèi)容物中所含菌落數(shù)的對數(shù)（lg CFU/g）表示[11]。

1.4.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

上述屠宰的籽鵝剪取空腸和回腸組織，去除內(nèi)容物，置于甲醛固定液中，脫水包埋后制成空腸和回腸組織石蠟切片，隨后進(jìn)行蘇木精-伊紅（H.E.）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)，分別測量各腸段絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD），并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度（V/C）值。

1.4.3 腸道pH上述屠宰籽鵝的空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物，直接使用pH計(jì)測定pH[12]。

1.4.4 免疫器官指數(shù)

上述屠宰的籽鵝仔細(xì)摘取胸腺、脾臟和法氏囊，并剔除脂肪和結(jié)締組織，然后用感量為0.01 g 的電子天平稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)[11]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANOVA單因素方差分析以及Duncan’s法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌對籽鵝腸道菌群的影響

試驗(yàn)期間籽鵝的健康狀況良好，無死亡。由表3可知，試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝盲腸中的乳酸菌數(shù)量極顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ和對照組（P<0.01），試驗(yàn)組Ⅰ籽鵝盲腸中的乳酸菌數(shù)量高于對照組，但無顯著差異（P>0.05）；試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝盲腸中的大腸桿菌數(shù)量和沙門氏菌數(shù)量均顯著低于對照組（P<0.05）；試驗(yàn)組Ⅰ籽鵝盲腸中的大腸桿菌數(shù)量和沙門氏菌數(shù)量低于對照組，但無顯著差異（P>0.05）。

表3 飼喂不同乳酸菌對籽鵝腸道菌群的影響（lg CFU/g）

2.2 不同乳酸菌對籽鵝腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝空腸VH顯著高于對照組（P<0.05），CD顯著低于對照組（P<0.05），V/C極顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ和對照組（P<0.01），試驗(yàn)組Ⅰ籽鵝空腸的V/C 顯著高于對照組（P<0.05）；試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝回腸的VH和V/C均顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ和對照組（P<0.05）。

2.3 不同乳酸菌對籽鵝腸道pH的影響

由表5可知，試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝的空腸pH顯著低于對照組（P<0.05），試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝的空腸、回腸和盲腸pH均低于試驗(yàn)組Ⅰ和對照組，試驗(yàn)組Ⅰ籽鵝的空腸、回腸和盲腸pH均低于對照組，但均無顯著差異（P>0.05）。

表5 飼喂不同乳酸菌對籽鵝腸道pH的影響

2.4 不同乳酸菌對籽鵝免疫器官指數(shù)的影響

由表6 可知，試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05），試驗(yàn)組Ⅱ籽鵝的脾臟指數(shù)顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ和對照組（P<0.05）。

表6 飼喂不同乳酸菌對籽鵝免疫器官指數(shù)的影響（mg/g）

3 討論

3.1 不同乳酸菌對籽鵝腸道菌群的影響

腸道菌群平衡對維持機(jī)體健康，保障宿主處于正常生理狀態(tài)十分重要[13]。乳酸菌產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乳酸，使腸道中的pH 和氧化還原電位（Eh）值降低，從而間接抑制致病菌的增殖[14]；乳酸菌還產(chǎn)生H2O2、細(xì)菌素、二乙酰、乙醛等廣譜抗菌物質(zhì)，抑制或殺滅鏈球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌，減少內(nèi)毒素及有害物質(zhì)的產(chǎn)生；乳酸菌能黏附在腸道黏膜表面，形成黏膜屏障，拮抗病原菌的黏附和定植。乳酸菌通過拮抗、抑制和定植抗力等方式抑制有害微生物過度繁殖，維持腸道菌群動態(tài)平衡[15-16]。李雪莉[17]研究表明，使用植物乳桿菌飼喂斷奶仔豬，可顯著提高盲腸和結(jié)腸中的乳酸菌數(shù)量，同時顯著降低大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂乳酸菌可以提高籽鵝腸道中乳酸菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量和沙門氏菌數(shù)量，且試驗(yàn)組Ⅱ乳酸菌數(shù)量高于試驗(yàn)組Ⅰ，大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量低于試驗(yàn)組Ⅰ，說明飼糧中添加乳酸菌可以調(diào)節(jié)籽鵝腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，改善腸道健康，自主篩選的乳酸菌調(diào)節(jié)腸道菌群平衡效果優(yōu)于普通乳酸菌。

3.2 不同乳酸菌對籽鵝腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與腸道消化吸收功能密切相關(guān)[18-20]。VH 與腸道內(nèi)表面積有關(guān)，CD 代表腸上皮細(xì)胞的成熟程度，V/C 反映腸黏膜功能狀態(tài)，VH、CD 和V/C 是考察腸道消化吸收能力的關(guān)鍵參數(shù)，VH 增加，CD降低，V/C提高，說明腸黏膜結(jié)構(gòu)改善，消化吸收能力增強(qiáng)[21-24]。乳酸菌能夠促進(jìn)益生菌在畜禽腸道內(nèi)黏附定植，其自身能產(chǎn)生許多特殊的酶系及各種維生素，二者均有利于腸上皮細(xì)胞生長，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。玄家潔[25]在肉雞飲水中添加3%的復(fù)合乳酸菌菌液，其十二指腸、空腸的VH 及V/C 顯著提高。張彩鳳[26]研究發(fā)現(xiàn)，在艾拔益加（AA）肉仔雞飼喂添加0.1%乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌劑的日糧，可顯著提高空腸的VH 和V/C。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂乳酸菌可以增加籽鵝空腸、回腸的VH，降低CD，提高V/C。試驗(yàn)組Ⅱ空腸V/C 極顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ，試驗(yàn)組Ⅱ回腸VH 和V/C 均顯著高于試驗(yàn)組Ⅰ，說明乳酸菌可以改善籽鵝腸道黏膜形態(tài)，自主篩選的乳酸菌保護(hù)效果優(yōu)于普通乳酸菌。

3.3 不同乳酸菌對籽鵝腸道pH的影響

適宜的腸道pH 能保證消化酶的活性，同時為腸道益生菌提供適宜的環(huán)境[27-29]。乳酸菌利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生多種有機(jī)酸，不僅可降低腸道內(nèi)pH，從而增強(qiáng)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且還能抑制腸道內(nèi)大腸桿菌等病原菌的生長和定植[14]。謝童等[12]使用復(fù)合乳酸菌制劑（乳酸桿菌、乳酸和苯乳酸）飼喂黃羽肉雞，0.3%添加組肉雞腺胃pH 顯著降低，0.2%和0.3%添加組十二指腸pH顯著降低。劉虎傳等[30]使用益生菌制劑（屎腸球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌）飼喂斷奶仔豬，可顯著降低28 日齡仔豬回腸內(nèi)容物pH。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂乳酸菌可以降低籽鵝腸道pH。試驗(yàn)組Ⅱ的空腸pH 顯著低于對照組，試驗(yàn)組Ⅱ的空腸、回腸和盲腸pH 均低于試驗(yàn)組Ⅰ，但差異不顯著，說明自主篩選的乳酸菌降低腸道pH 效果優(yōu)于普通乳酸菌。

3.4 不同乳酸菌對籽鵝免疫器官指數(shù)的影響

禽類體內(nèi)主要的免疫器官是胸腺、脾臟和法氏囊。胸腺和法氏囊分別是T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞分化增殖的主要場所[11,31]；脾臟參與體液免疫和細(xì)胞免疫[32]。免疫器官指數(shù)與機(jī)體免疫水平密切相關(guān)，免疫器官指數(shù)升高，說明機(jī)體免疫功能增強(qiáng)[33-35]。程鵬等[36]研究表明，肉雞飼喂乳酸菌菌液可提高生產(chǎn)性能及免疫功能，其中拌料組和飲水組可顯著提高1～21日齡胸腺指數(shù)，灌服組可顯著提高22～42 日齡胸腺指數(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂乳酸菌可以提高籽鵝的免疫器官指數(shù)。試驗(yàn)組Ⅱ的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于對照組，而試驗(yàn)組Ⅰ的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)雖高于對照組，但差異不顯著，說明自主篩選的乳酸菌提高籽鵝免疫力的能力優(yōu)于普通乳酸菌。

每種微生物都有其最適生長溫度，當(dāng)環(huán)境溫度明顯高于該最適溫度時，微生物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸及各種酶類因熱力作用活性降低或消失，導(dǎo)致生長代謝受到抑制甚至菌體死亡。本研究分離的乳酸片球菌的最適生長溫度為42 ℃，與籽鵝體溫一致，可以更好地適應(yīng)籽鵝腸道環(huán)境，從而在較短時間內(nèi)成為腸道優(yōu)勢菌群，發(fā)揮益生作用。而目前市售普通乳酸菌主要應(yīng)用在家畜養(yǎng)殖過程中，其最適生長溫度為37 ℃，與家畜的體溫一致。本研究結(jié)果顯示，普通乳酸菌在42 ℃條件下，其生長代謝受到抑制，難以充分發(fā)揮益生作用。所以本研究分離的乳酸片球菌相比市售普通乳酸菌，可以更好地改善籽鵝腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生長性能。

4 結(jié)論

① 飼糧中添加乳酸菌可以提高籽鵝腸道中乳酸菌數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量和沙門氏菌數(shù)量；增加籽鵝腸道VH，降低CD，提高V/C；降低籽鵝腸道pH；提高籽鵝的免疫器官指數(shù)。

② 自主分離乳酸菌在維持籽鵝腸道菌群平衡、改善腸道黏膜形態(tài)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面的效果優(yōu)于普通乳酸菌。