PCR 法快速鑒定小兒咳喘靈顆粒中大腸埃希菌*

金昊嵩，趙中開，胡 鳳，韓志雙

（四川省自貢檢驗檢測院，四川自貢 643000）

小兒咳喘靈顆粒常用于治療兒童哮喘、支氣管肺炎等疾?。?］，屬《中國藥典》規(guī)定的非無菌不含藥材原粉的中藥口服固體制劑。依據(jù)2020 年版《中國藥典（四部）》微生物限度規(guī)定，大腸埃希菌屬該品種項下最基本的微生物控制菌檢測項目。大腸埃希菌為革蘭陰性兼性厭氧桿菌，是人和動物腸道中的正常棲居菌，同時也是一種條件致病菌，其某些血清型能產(chǎn)生腸毒素，具有致病性。該菌在臨床的感染率和耐藥性均較高，已成為威脅患者健康的常見病原菌［2］。2015及2020年版《中國藥典》均提到，分離純化可疑菌后應(yīng)使用適宜的鑒定試驗確證是否為大腸埃希菌，但未具體規(guī)定選用何種鑒定方法。大腸埃希菌屬常規(guī)鑒定主要采用生化反應(yīng)法，如4-甲基傘形酮葡糖酸酐（MUG）試驗、靛基質(zhì)（吲哚）試驗和IMViC 試驗［3］［為靛基質(zhì)（I）試驗、甲基紅（MR）試驗、乙酰甲基甲醇生成（VP）試驗、枸櫞酸鹽利用（C）試驗等的合稱］。本研究中擬采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法，優(yōu)先選擇大腸埃希菌的特征基因uidA 進(jìn)行檢測。該基因參與編碼β-D-葡糖醛酸酶，有相對特異性，已用于檢測大腸埃希菌的眾多表型和分子分析［4-5］，但查閱文獻(xiàn)［6］和試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分志賀菌屬的uidA 基因檢測結(jié)果也可能為陽性。侵襲性質(zhì)?？乖璈 基因（ipaH 基因）為負(fù)責(zé)上皮細(xì)胞滲透和細(xì)胞間傳播的關(guān)鍵，在志賀菌的染色體和質(zhì)粒上存在多個拷貝［7］。目前已將該基因作為檢測靶點運用于志賀菌的快速檢測［8］。但其也是腸道侵襲性大腸埃希菌（EIEC）的特征基因，該基因檢測無法準(zhǔn)確區(qū)分志賀菌和EIEC［9］。故又加入侵襲性質(zhì)粒調(diào)節(jié)基因（invE），該基因在EIEC 檢驗中與ipaH 基因等效［10］，可作為EIEC 特征基因進(jìn)行檢測。根據(jù)3 種基因檢測結(jié)果共同判定，為菌屬的快速鑒定提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LightCycler96 型PCR 儀（瑞士Roche 公司）；EPS -600 型電泳儀、Tanon - 3500 型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 材料

藥品：選用小兒咳喘靈顆粒［11］（相關(guān)信息見表1）。

表1 藥品相關(guān)信息Tab.1 Relevant information of drugs

試劑：Premix Ex Taq HS預(yù)混液（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號為AKG2211A）、10×Loading Buffer、Marker DL500（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號為AJE1680A）；瓊脂糖、50 × TAE 緩沖液、Marker DL2000（生工生物工程股份有限公司，批號分別為H902BA0030，G612KA5970，G701KA6075）；4S GelRed 核酸染料（BBI生命科學(xué)有限公司，批號為H809KA1140）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號為1114012）、肉桂基硫酸鹽胰蛋白胨（MUG）肉湯培養(yǎng)基（LST - MUG，批號為1094511）、腦心浸出液肉湯（BHI，批號為1101561），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；大腸桿菌IMViC生化鑒定管（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號為20220225）；水為無菌水。

菌株：22種（24株）試驗菌株相關(guān)信息見表2。其中，b，m 菌株來源于中國食品藥品檢定研究院（m 菌株為其行沙門能力驗證樣品分離獲得）；o-s，u，x菌株來源于為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；其余菌株均來源于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。ETEC 為產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌；EHEC 為腸道出血性大腸埃希菌；EIEC 為腸道侵襲性大腸埃希菌；EPEC 為腸道致病性大腸埃希菌；EAEC 為腸道集聚性大腸埃希菌。志賀菌屬根據(jù)其生化和血清學(xué)特征分為痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內(nèi)氏志賀菌。

表2 試驗菌株Tab.2 Test bacterial strains

引物：參考文獻(xiàn)［10］，確定uidA，ipaH，invE 基因的引物序列，委托寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司合成，用Tris-EDTA（TE）緩沖液稀釋至工作濃度（分別為5，5，2.5 μmol/L）。引物序列信息見表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2 方法與結(jié)果

2.1 PCR 試驗

2.1.1 方法

供試液制備：取菌株樣品各適量，分別接種至BHI培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h得增菌液，用生理鹽水稀釋成含菌量約100 cfu/mL 的菌懸液。稱取樣品10 g，置100 mL TSB 中充分溶解，制成1∶10（m/V）的供試品溶液，再分別加入菌懸液1 mL，36 ℃培養(yǎng)24 h。

DNA 提?。喝∨囵B(yǎng)后的TSB 培養(yǎng)基增菌液1 mL，15 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入1 mL無菌水振蕩懸浮沉淀，15 000 r/ min 離心5 min，棄上清液；再向沉淀中加入500 μL 無菌水，振蕩使其充分懸??；100 ℃水浴加熱15 min，12 000 r/ min 離心5 min，取上清液，即得DNA模板溶液。

PCR 反應(yīng)體系配制：反應(yīng)總體積25 μL，分別加入Premix Ex Taq HS 預(yù)混液12.5 μL，上下游引物各1 μL，無菌水8.5 μL，DNA模板2 μL。

PCR擴增條件：預(yù)變性95 ℃5 min；變性95 ℃30 s，退火63 ℃30 s，延伸72 ℃90 s，循環(huán)30次；延伸72 ℃5 min。

電泳：用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，電壓5 V/cm，時間45 min。以凝膠成像結(jié)果條帶位于1 000～2 000，500～750，750 bp分別為uidA，ipaH，invE基因陽性。

2.1.2 結(jié)果

大腸埃希菌和主要致病菌uidA基因檢測結(jié)果見圖1。其中marker1 為marker DL500，marker2 為marker DL2000。uidA 基因PCR 檢測可區(qū)分大腸埃希菌與大部分常見致病菌，但無法區(qū)分某些志賀菌（如宋內(nèi)氏志賀菌）與大腸埃希菌。志賀菌與大腸埃希菌在基因?qū)用嫔贤葱暂^高［12］，在NBCI 的GenBank 中搜索發(fā)現(xiàn)，宋內(nèi)氏志賀菌、鮑氏志賀菌的染色體上也存在uidA 基因序列（如CP064376.1，1428190 - 1429696，CP068090.1，103038-104513）。為有效區(qū)分志賀菌和大腸埃希菌，本研究中先后加入了志賀菌屬的特征基因ipaH和invE基因。

圖1 大腸埃希菌和主要致病菌uidA基因檢測結(jié)果Fig.1 Results of uidA gene testing of Escherichia coli and major pathogenic bacteria

3 種基因檢測結(jié)果見圖2、圖3 及表4。圖2 中，條帶1-7 為ipaH 基因，8-14 為invE 基因；每組從左至右依次為a，s，r，p，o，q，t；條帶15 為marker DL2000。圖3 中，條帶1-8 為ipaH 基因，10-17 為invE 基因，18-25 為uidA 基因；每組從左到右依次為空白，x，w，v，u，q，p，b；條帶9為DL2000。

圖2 大腸埃希菌與福氏志賀菌的2種基因檢測結(jié)果Fig.2 Results of two gene testing of Escherichia coli and Shigella flexneri

圖3 大腸埃希氏菌與志賀菌的3種基因檢測結(jié)果Fig.3 Results of three gene testing of Escherichia coli and Shigella species

表4 3種基因的檢測及判定結(jié)果Tab.4 Results of testing and identification of three genes

由表4 可知，大腸埃希菌和志賀菌均約有2 種結(jié)果組合，其中前者除EIEC 外，其余結(jié)果均一致；且2 種菌的結(jié)果組合均無重疊，故能通過本方法區(qū)分［13］。但本試驗結(jié)果顯示，EIEC除能檢出ipaH基因外，還能檢出invE基因，而4 種志賀菌均不能檢出invE 基因，因此invE 基因可進(jìn)一步區(qū)分EIEC和志賀菌屬，得以下判定規(guī)則。當(dāng)結(jié)果為uidA 基因陰性時可判定為大腸埃希菌未檢出（但uidA，ipaH，invE 基因結(jié)果為+ - - 時可判定為大腸埃希菌，為+ + +時可判定為EIEC，其余結(jié)果則為非大腸埃希菌。

2.2 生化試驗

方法：將2.1.1 項下供試液分別劃線接種于LST -MUG 中，36 ℃培養(yǎng)24 h；同時取2.1.1 項下供試液分別進(jìn)行IMViC 試驗：I試驗36 ℃下培養(yǎng)24 h，MR試驗36 ℃下培養(yǎng)96 h，VP試驗36 ℃下培養(yǎng)48 h，C試驗36 ℃下培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后的LST - MUG 置366 nm 波長紫外光下觀察；將培養(yǎng)后的IMViC 試管分別滴加I 試劑、MR -VP試劑，并觀察。

結(jié)果：結(jié)果見表4（IMViC 項結(jié)果分別采自I，MR，VP，C試驗）。

3 討論

3.1 特異（專屬）性

本研究中選擇PCR 方法的目的為檢測目標(biāo)基因的特異性，故選擇的22 種（24 株）病原微生物均為食品藥品檢驗實驗室常見品種。本研究結(jié)果顯示，uidA 基因在大部分情況下具備大腸埃希菌檢測的特異性，但志賀菌和EIEC 的特殊性使ipaH 和invE 基因的加入成為必要，運用3 種基因組合判斷，只需1 次PCR 檢測即可判定大腸埃希菌；而在生化試驗中，MUG 試驗的產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌同為產(chǎn)氣熒光，弗氏檸檬酸桿菌和EHEC 同為產(chǎn)氣無熒光，證明單用該方法無法準(zhǔn)確區(qū)分產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌，且EHEC可能存在漏檢。少部分非典型大腸埃希菌IMViC試驗結(jié)果為- + - -［14］，與大部分志賀菌反應(yīng)相同，且愛德華氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和部分志賀菌試驗結(jié)果可能為+ + - -［15］?？梢?，在實際鑒定工作中單用任何一種生化試驗方法均存在不確定性，需聯(lián)用多種試驗保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 鑒定效率

本研究使用的PCR 法全過程耗時短，提取擴增時間可在半天內(nèi)完成，且樣本基因組DNA模板采用直接熱裂解提取法，過程較簡單，經(jīng)裂解后的菌懸液樣本無生物活性，后續(xù)操作過程中安全性較高；而使用生化鑒定法時，通常需培養(yǎng)24 h 以上，特別是甲基紅試驗產(chǎn)酸培養(yǎng)需3～5 d，耗時較長，試驗項目多操作較煩瑣。另外，生化試驗中的樣本多為新鮮培養(yǎng)物，生物安全風(fēng)險較大。

3.3 小結(jié)

綜上所述，本研究中建立了快速檢測鑒定小兒咳喘靈顆粒中大腸埃希菌的PCR 法，其專屬性和工作效率等方面相比傳統(tǒng)微生物檢測鑒定方法有較大優(yōu)勢，在大腸埃希菌的快速篩查鑒定工作中，使用該方法直接從供試品增菌液中提取DNA 進(jìn)行檢測可作為初期污染調(diào)查和溯源的優(yōu)選工作手段之一。需注意的是，在TSB增菌液中提取DNA時，為保證增菌液生長濃度和提取效率，仍需考慮供試品的抑菌特性，之前應(yīng)先進(jìn)行方法適用性試驗，確認(rèn)該藥品不會對大腸埃希菌產(chǎn)生抑菌性或采用適宜方法消除抑菌性［16］后方可進(jìn)行試驗。