市售香砂養(yǎng)胃丸質(zhì)量評(píng)價(jià)*

仝立卿，毛頤晴，曹 玉

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京 211198）

香砂養(yǎng)胃丸為《國(guó)家基本藥物目錄》（2012 年版）收錄的甲類藥品，由木香、砂仁、陳皮、枳實(shí)（炒）、厚樸、香附等14味藥材組方，具有溫中和胃功效，臨床用于治療胃陽(yáng)不足、濕阻氣滯所致胃痛［1］。香砂養(yǎng)胃丸包括水丸、濃縮丸、大蜜丸3種劑型，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅考察了陳皮、枳實(shí)和厚樸指標(biāo)成分的含量，未涉及君藥木香，故無(wú)法防控木香偽品風(fēng)險(xiǎn)。指紋圖譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥內(nèi)在化學(xué)成分的綜合評(píng)價(jià)和對(duì)整體質(zhì)量的全面控制［2-8］。目前，僅見香砂養(yǎng)胃丸濃縮丸的水提液和不同極性部位的高效液相色譜指紋圖譜研究［9-10］，以及水丸的特征圖譜研究［11］。本研究中建立了香砂養(yǎng)胃丸3種劑型的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并對(duì)55 批市售香砂養(yǎng)胃丸進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)檢測(cè)樣品中是否混用川木香、土木香和藏木香，旨在為全面控制及評(píng)價(jià)香砂養(yǎng)胃丸的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H - Class 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；XPE26 型、XSE205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ - 250 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DQ5 型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

市售香砂養(yǎng)胃丸55 批，其中水丸樣品35 批（生產(chǎn)企業(yè)代號(hào)S1 - S35），濃縮丸樣品18 批（生產(chǎn)企業(yè)代號(hào)S17、S36 - S46，其中S38 - S40 企業(yè)、S44 - S46 企業(yè)各有2 批），大蜜丸樣品2 批（生產(chǎn)企業(yè)代號(hào)S26、S33）。木香藥材和飲片23 批（1 號(hào)- 23 號(hào)），川木香藥材和飲片4 批（1 號(hào)- 4 號(hào)）；紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)為111574 -202106，含量94.3%）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110722 -202116，含量93.5%）、新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111857-201804，含量99.4%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610 -201908，含量95.0%）、甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731-202021，含量96.2%）、厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110729 -202015，含量99.0%）、和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)為110730-201915，含量99.8%）、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111524 - 201911，含量99.9%）、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111525-201912，含量99.5%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為110721 - 202019，含量95.3%）、川陳皮素對(duì)照品（批號(hào)為112055- 202102，含量99.7%）、土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為110760-201811，含量99.4%）、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為110761-201806，含量97.4%），木香對(duì)照藥材（批號(hào)為120921 - 202010）、砂仁對(duì)照藥材（批號(hào)為120985 - 201406）、枳實(shí)對(duì)照藥材（批號(hào)為120936 - 201606）、陳皮對(duì)照藥材（批號(hào)為120969 -202011）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120969 - 202011）、半夏對(duì)照藥材（批號(hào)為121272 - 201806）、廣藿香對(duì)照藥材（批號(hào)為121135 - 202107）、白術(shù)對(duì)照藥材（批號(hào)為120925 - 202013）、香附對(duì)照藥材（批號(hào)為121059 -201808）、厚樸對(duì)照藥材（批號(hào)為121285 - 201303）、川木香對(duì)照藥材（批號(hào)為121091-201104）、藏木香對(duì)照藥材（批號(hào)為121630-201001）、土木香對(duì)照藥材（批號(hào)為121090 - 201803），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。維采寧Ⅱ?qū)φ掌罚ㄌ旖虬査萍加邢薰?，批?hào)為FS1601540，含量99.4%）；蕓香柚皮苷對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)為10285，含量98.7%）。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC?HSS T3 柱（150 mm ×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8.5 min 時(shí)5%A →20%A，8.5～12 min 時(shí)20%A，12～22 min 時(shí)20%A →30%A，22～30 min時(shí)30%A →47%A，30～40 min時(shí)47%A →50%A，40～50 min 時(shí)50%A →70%A，50～53 min 時(shí)70%A，53～60 min 時(shí)70%A →90%A）；流速：0.3 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm（0～13 min），284 nm（13～25 min），254 nm（25～35 min），225 nm（35～60 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 溶液制備

取紫丁香苷、維采寧Ⅱ、柚皮苷、新橙皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、川陳皮素對(duì)照品各適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為20.78，27.79，28.50，37.91，26.90，97.45，28.09，31.15，100.40，69.75，42.14，62.88，41.29 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。取濃縮丸、水丸樣品（研細(xì)）、大蜜丸樣品（剪碎）各2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取木香、砂仁、枳實(shí)、陳皮、甘草、半夏、廣藿香、白術(shù)、香附、厚樸對(duì)照藥材各0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備單一對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取水丸樣品（批號(hào)為20220101）適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。以9 號(hào)色譜峰（橙皮苷）為參照峰，結(jié)果各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD均小于3.50%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品（批號(hào)為20220101）溶液適量，室溫下分別于0，2，4，8，16，24 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以9 號(hào)色譜峰（橙皮苷）為參照峰，結(jié)果各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD均小于3.50%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取水丸樣品（批號(hào)為20220101）和濃縮丸樣品（批號(hào)為210616）各適量，各6 份，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以9號(hào)色譜峰（橙皮苷）為參照峰，結(jié)果各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD均小于3.50%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜建立

取水丸、大蜜丸、濃縮丸樣品各適量，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）軟件，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10 min，按平均數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，分別生成UPLC 疊加指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜。詳見圖1和圖2（其中濃縮丸由于工藝不同，18 號(hào)、20 號(hào)峰缺失；X、Y 色譜峰分別為柚皮苷峰和新橙皮苷峰）。結(jié)果水丸和大蜜丸各確定23個(gè)共有峰，濃縮丸確定21個(gè)共有峰。

a. 水丸 b. 濃縮丸 c. 大蜜丸圖1 各企業(yè)香砂養(yǎng)胃丸超高效液相色譜疊加指紋圖譜a.Water pills b.Concentrated pills c.Big honeyed pillsFig.1 UPLC superimposed fingerprint of Xiangsha Yangwei Pills from various enterprises

a. 水丸 b. 濃縮丸 c. 大蜜丸圖2 香砂養(yǎng)胃丸超高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜a.Water pills b.Concentrated pills c.Big honeyed pillsFig.2 UPLC reference fingerprint of Xiangsha Yangwei Pills

2.1.5 共有峰指認(rèn)、歸屬及參照峰選擇

取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和單一對(duì)照藥材溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見圖3和圖4）。根據(jù)對(duì)照品溶液色譜峰的保留時(shí)間，共指認(rèn)11個(gè)成分，分別為紫丁香苷（峰3）、維采寧Ⅱ（峰5）、甘草苷（峰7）、蕓香柚皮苷（峰8）、橙皮苷（峰9）、甘草酸銨（峰11）、川陳皮素（峰12）、和厚樸酚（峰15）、木香烴內(nèi)酯（峰16）、去氫木香內(nèi)酯（峰19）、厚樸酚（峰22）。將樣品對(duì)照指紋圖譜與對(duì)照藥材色譜圖對(duì)比，水丸、大蜜丸均歸屬12 個(gè)共有峰，濃縮丸歸屬10 個(gè)共有峰。1 號(hào)、2 號(hào)峰同時(shí)歸屬陳皮和枳實(shí)，10 號(hào)峰歸屬陳皮；4 號(hào)峰歸屬砂仁；21 號(hào)峰歸屬厚樸；17 號(hào)峰歸屬白術(shù)；23 號(hào)峰歸屬半夏，6 號(hào)、13 號(hào)、14 號(hào)、18 號(hào)峰歸屬?gòu)V藿香，20號(hào)峰歸屬香附。其中9 號(hào)峰橙皮苷為陳皮、枳實(shí)的指標(biāo)性成分，該峰保留時(shí)間適中、吸收強(qiáng)、分離度好，故作為參照峰。

3. 紫丁香苷 5. 維采寧Ⅱ 7. 甘草苷 8. 蕓香柚皮苷 9. 橙皮苷11. 甘草酸銨 12. 川陳皮素 15. 和厚樸酚 16. 木香烴內(nèi)酯19. 去氫木香內(nèi)酯 22. 厚樸酚圖3 混合對(duì)照品溶液超高效液相色譜圖3.Syringin 5.Vicenin Ⅱ 7.Liquiritin 8.Narirutin 9.Hesperidin 11.Glycyrrhizic acid ammonium salt 12.Nobiletin 15.Honokiol 16.Costunolide 19.Dehydrocostus lactone 22.MagnololFig.3 UPLC chromatograms of mixed reference solution

C1. 香附 C2. 砂仁 C3. 廣藿香 C4. 半夏 C5. 白術(shù)C6. 枳實(shí)（炒） C7. 木香 C8. 厚樸 C9. 甘草 C10. 陳皮圖4 對(duì)照藥材溶液超高效液相色譜圖C1.Cyperi Rhizoma C2.Amomi Fructus C3.Pogostemonis Herba C4.Pinelliae Rhizoma C5.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma C6.Stir-fried Aurantii Fructus Immaturus C7.Aucklandiae Radix C8.Magnoliae Officinalis Cortex C9.Glycyrrhizae Radix et Rhizoma C10.Citri Reticulatae PericarpiumFig.4 UPLC chromatograms of reference medicinal solution

2.1.6 相似度評(píng)價(jià)

取35 批水丸樣品、18 批濃縮丸樣品、2 批大蜜丸樣品各適量，精密稱定，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得UPLC 色譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）軟件，結(jié)果見表1，提示不同生產(chǎn)企業(yè)和不同批間樣品的質(zhì)量可能存在差異。濃縮丸的相似度與水丸和大蜜丸相比更低，相似度低于0.90 的水丸樣品占8.57%，濃縮丸樣品占55.56%，大蜜丸樣品占50.00%。

2.2 木香摻偽檢查

2.2.1 溶液制備

分別取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯對(duì)照品各適量，加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度均為50 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。取木香、川木香、土木香和藏木香對(duì)照藥材各0.5 g，精密稱定，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備單一對(duì)照藥材溶液。取55 批樣品，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取23 批木香藥材和飲片及4 批川木香藥材和飲片各1 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備單一藥材溶液。

2.2.2 方法與結(jié)果

取上述溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。詳見圖5。計(jì)算木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯的峰面積比值，結(jié)果見表1和表2。

表2 川木香與木香峰面積比值Tab.2 Peak - area ratio of costunolide to dehydrocostus lactone in Vladimiriae Radix and Aucklandiae Radix

1.木香烴內(nèi)酯 2.去氫木香內(nèi)酯 3.異土木香內(nèi)酯 4.土木香內(nèi)酯A. 供試品溶液（樣品批號(hào)210616） B. 混合對(duì)照品溶液C-F. 對(duì)照藥材溶液（分別為藏木香、土木香、木香、川木香）圖5 木香摻偽檢查超高效液相色譜圖1.Costunolide 2.Dehydrocostus lactone 3. Isoalantolactone 4.AlantolactoneA.Test solution（sample batch number：210616） B.Mixed reference solution C-F.Reference medicinal solution（Inula racemosa，Inulae Radix，Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，respectively）Fig.5 UPLC chromatograms of adulteration inspection of Aucklandiae Radix

不同木香藥材樣品比較：木香與川木香藥材均檢出木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯，土木香與藏木香藥材均檢出土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯。55批樣品中均未檢出土木香內(nèi)酯與異土木香內(nèi)酯，提示未混用藏木香或土木香。

木香與川木香藥材區(qū)分：木香藥材、飲片（1號(hào)-23號(hào)）的平均峰面積比值為1.12；川木香藥材、飲片（1 號(hào)-4 號(hào)）的平均值為0.49，均與對(duì)照藥材接近。水丸、大蜜丸和濃縮丸的平均峰面積比值分別為0.96，1.04，0.71。初步確定峰面積比值＜0.6的為川木香，≥0.6的木香。結(jié)果4 批水丸和2 批濃縮丸（涉及6 個(gè)廠家）木香烴內(nèi)酯與去氫木香內(nèi)酯的峰面積比值＜0.6，可能混有川木香。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中流動(dòng)相考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液，根據(jù)分離效果和色譜峰峰形，最終采用乙腈- 0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫）；根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm 波長(zhǎng)內(nèi)的掃描結(jié)果，在不同時(shí)間段進(jìn)行275，284，254，225 nm波長(zhǎng)的切換，檢測(cè)到的色譜峰最多，且基線穩(wěn)定；考察了樣品前處理的提取溶劑50%甲醇、70%甲醇、甲醇，并比較超聲提取和加熱回流提取的提取效果，結(jié)果以甲醇超聲提取30 min時(shí)各組分的提取效率較高。

2020 年版《中國(guó)藥典》中枳實(shí)為蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果，以酸橙投料的制劑樣品中能檢出橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷，以甜橙投料的制劑樣品僅檢出橙皮苷，故柚皮苷和新橙皮苷未列入對(duì)照指紋圖譜共有峰。

香砂養(yǎng)胃丸中水丸、大蜜丸均為全原粉入藥，制劑工藝簡(jiǎn)單；濃縮丸工藝復(fù)雜，木香等7 種藥材提取揮發(fā)油成分后再混合入藥，提取與混勻過程中可能造成揮發(fā)性成分含量降低，影響其與對(duì)照指紋圖譜的一致性。本研究中建立的UPLC 指紋圖譜，可同時(shí)檢測(cè)制劑中是否混用土木香和藏木香，且在木香與川木香鑒別中，初步擬定峰面積比值低于0.6的為川木香；但由于藥材和飲片的新鮮程度、存儲(chǔ)時(shí)間、制備工藝等會(huì)影響木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量［12-13］，故不能完全排除樣品中川木香和木香混用的可能。本研究結(jié)果顯示，生產(chǎn)廠家S17的1批次水丸和1批次濃縮丸樣品的相似度均低于0.850，峰面積比值與該廠家提供的木香16號(hào)藥材測(cè)得峰面積的比值相差較大。故該廠家的香砂養(yǎng)胃丸實(shí)際投料用的原料木香可能存在質(zhì)量問題或投料量不足，其制備工藝也可能存在缺陷。

綜上所述，本研究中建立的方法能同時(shí)鑒定香砂養(yǎng)胃丸中木香及其易混品，從而可對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行快速評(píng)價(jià)。