玄麥甘桔制劑中多效唑殘留量檢測*

胡 亮，孫 輝，丁 野，羅 艷，李文莉，李靖云△

（1. 湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南長沙 410001； 2. 湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410001）

玄麥甘桔制劑主要有顆粒、膠囊和含片3 種劑型，全國共有生產(chǎn)企業(yè)65 家，國藥準(zhǔn)字65 個，應(yīng)用較廣。其處方由玄參、麥冬、桔梗和甘草4味藥材組成，具有清熱滋陰、祛痰利咽功效，可用于治療陰虛火旺、虛火上浮、口鼻干燥、咽喉腫痛［1-3］。處方中麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L. f）Ker - Gawl. 的干燥塊根［4］，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2020年版《中國藥典（一部）》，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心功效，多用于治療肺燥干咳、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴等證［5］。目前，麥冬多為栽培品，在栽培過程中可能使用以多效唑、丁酰肼、矮壯素、縮節(jié)胺等植物生長調(diào)節(jié)劑，可顯著促進(jìn)麥冬塊根的形成，達(dá)到增產(chǎn)目的［6-9］。其中“壯根靈”類生長調(diào)節(jié)劑中多效唑使用普遍，其理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，但降解較緩慢，在土壤中的吸附率高，殘留較嚴(yán)重。植物根系在吸收土壤中營養(yǎng)的同時，也會吸收土壤中殘留的多效唑，再通過飲食或食物鏈的富集進(jìn)入體內(nèi)，對人體健康造成安全隱患［10-13］。本研究中基于QuEchERS 技術(shù)，建立了檢測成方制劑中多效唑殘留量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - MS/MS）法，同時考察了16 批次麥冬藥材中多效唑的殘留量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000 型超高效液相色譜儀、TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；AE240 型電子天平（精度為0.1 mg）、XSE205DU 型電子天平（精度為0.01 mg），均購自瑞士Mettler Toledo 公司；KQ500DE 型超聲波清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

多效唑?qū)φ掌罚ㄉ虾０沧V璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號為2100922，含量95.2%）；WondaPak QuECh-ERS 醋酸鈉提取包［批號為5010050021，含無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1，m/m）7.5 g］，凈化包［含無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺（PSA）300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化炭黑90 mg］，固相萃取凈化管，均購自日本Shimadzu 公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水；237批次玄麥甘桔制劑樣品，涉及32家生產(chǎn)企業(yè)，其中顆粒劑229批次、膠囊和含片各4批次，來源為2022年國家藥品監(jiān)督管理局玄麥甘桔制劑品種抽驗工作抽驗樣品；麥冬藥材16批，均為企業(yè)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Welch Ultimate LP - C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/ L 乙酸銨溶液（55∶45，V/V）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為3 μL。

質(zhì)譜條件：TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜儀，采用電噴霧正離子（ESI+）模式，噴霧電壓為3 800 V，鞘氣流速為35 Arb，輔助氣流速為15 Arb，離子傳輸管溫度為350 ℃，蒸發(fā)溫度為300 ℃，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。多效唑選擇m/z294.0 → 70.2、m/z294.0 →125.0 作為檢測離子對，碰撞能量分別為20，36 V。取對照品溶液，進(jìn)樣3 μL，按上述離子對測定的MRM色譜峰的信噪比應(yīng)大于10∶1。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取多效唑?qū)φ掌?2.03 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得對照品溶液Ⅰ（質(zhì)量濃度為120.3 μg/mL）；精密吸取1 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得對照品溶液Ⅱ（質(zhì)量濃度為2.406 μg/mL）；精密吸取1 mL 置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，即得對照品溶液Ⅲ（質(zhì)量濃度為240.6 ng/mL）。

供試品溶液與陰性對照品溶液：取樣品內(nèi)容物［顆粒10 g（含糖型）或5 g（無糖型），膠囊、含片各10 g］，研細(xì)，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，超聲（功率500 W、頻率40 kHz，下同）處理15 min，精密加入乙腈15 mL，1 500 次/分振蕩5 min，冰浴中冷卻30 min；加入QuEchERS 提取包，立即搖散，1 500次/分振蕩5 min，8 000 r/min離心5 min；取上清液9 mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，凈化管中加入QuEchERS 凈化包，渦旋使充分混勻，2 000次/分振蕩5 min使凈化完全，8 000 r/min離心5 min；取上清液，濾過。以供試品溶液中未檢出多效唑的為陰性對照品溶液，檢出多效唑的為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取對照品溶液Ⅲ、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子流圖。結(jié)果，陰性對照品溶液在與多效唑?qū)φ掌啡芤罕Ａ魰r間相同處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

A. 對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對照品溶液圖1 離子流圖A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 Ion chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2 項下對照品溶液Ⅱ1 mL，分別置10，20，50，100，200，500 mL 容量瓶中，用甲醇定容，即得系列對照品溶液。精密量取3 μL，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子相對豐度。以多效唑質(zhì)量濃度（X，ng/ mL）為橫坐標(biāo)、m/z294.0 →70.2 離子相對豐度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 10 574X- 10 766（r= 0.999 8）。結(jié)果表明，多效唑質(zhì)量濃度在4.812～240.6 ng/ mL 范圍內(nèi)與離子相對豐度線性關(guān)系良好。

檢測限考察：取線性最低點（質(zhì)量濃度4.812 ng/mL）及供試品溶液各適量，倍比稀釋，以m/z294.0 →70.2作為檢測離子，按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，按信噪比（S/N）約為39進(jìn)行折算。結(jié)果儀器檢測限為0.11 pg，方法檢測限分別為0.055 ng/ g（含糖型顆粒劑、膠囊劑、片劑），0.11 ng/g（無糖型顆粒劑）。

精密度試驗：取2.2項下供試品溶液適量，按2.1項下試驗條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄離子相對豐度。結(jié)果的RSD為2.74%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，12，18，24 h時按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子相對豐度。結(jié)果的RSD為1.76%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱取同一批樣品適量，各6份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子相對豐度并計算含量。結(jié)果多效唑平均含量為101.77 ng/ g，RSD為1.76%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（101.77 ng/g）適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的多效唑?qū)φ掌啡芤海?.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下試驗條件進(jìn)樣測定，記錄離子相對豐度，并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取16批麥冬藥材樣品及237批玄麥甘桔制劑樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下試驗條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄離子相對豐度，并計算樣品含量。結(jié)果16 批麥冬藥材樣品均檢出多效唑，檢出含量范圍0.006～0.469 mg/kg。208 批次制劑樣品（87.76%）檢出多效唑，涉及全部生產(chǎn)企業(yè)；含糖型顆粒、無糖型顆粒、膠囊劑、含片樣品檢出范圍分別為0.000 7～0.377 3 mg/ kg、0.015 0～0.096 2 mg/ kg、0.214 3～0.246 8 mg/kg、0.037 6～0.059 5 mg/kg。按麥冬中多效唑0.5 mg/kg（我國規(guī)定其在水果谷物中最高殘留限量為0.2～0.5 mg/kg）折算，各制劑中的多效唑限度分別不得過0.04，0.08，0.137，0.571 mg/kg。結(jié)果24 批次超出擬訂限度，均為含糖型顆粒劑，涉及7 家生產(chǎn)企業(yè)，詳見表2。

表2 多效唑超限玄麥甘桔顆粒樣品（含糖型）含量（mg/kg）Tab.2 Content of paclobutrazol in the sugar-containing Xuanmai Ganju Granules with paclobutrazol over the limit（mg/kg）

3 討論

本研究中采用質(zhì)譜檢測器對多效唑進(jìn)行檢測，具有靈敏度高、專屬性強的特點。采用ESI+模式，設(shè)定在質(zhì)譜二級裂解過程中碎片離子的掃描范圍（從50 amu到比母離子大50 amu），監(jiān)測其分子離子峰豐度變化情況，m/z294.0 作為母離子產(chǎn)生顯著豐度的m/z70.2及m/z125.0等碎片離子，其中以豐度最高的子離子m/z70.2作為定量離子對。以多效唑的回收率為指標(biāo)對超聲時間（5，10，15，20 min）進(jìn)行考察，結(jié)果表明隨著時間的延長回收率增加明顯，但15 min 和20 min 回收率相當(dāng)，故最終選擇15 min 作為超聲時間。對不同提取溶劑（甲醇、乙腈）提取效果進(jìn)行了考察，乙腈提取可避免樣品基質(zhì)中糖類和脂溶性色素等因素的干擾，提取更完全，故選擇乙腈作為提取溶劑。

植物生長延緩劑屬農(nóng)藥，不同國家水果蔬菜中的殘留量均有相應(yīng)規(guī)定，多效唑因其在土壤中的半衰期較長，有可能對非靶目標(biāo)產(chǎn)生危害，許多歐盟國家已經(jīng)禁用。日本、新西蘭、韓國、澳大利亞等國規(guī)定多效唑的最高殘留限量為0.5 mg/kg，我國規(guī)定多效唑在水果谷物中最高殘留限量為0.2～0.5 mg/kg［14-16］，但對中藥材、中成藥無相關(guān)規(guī)定?？疾煨湼式壑苿悠泛望湺幉闹卸嘈н虺煞謺r以不同體質(zhì)量患者多效唑每日允許攝入量為基準(zhǔn)，按2020 年版《中國藥典（一部）》麥冬項下最大使用量12 g 和多效唑最高含量0.469 mg/ kg計算［16］，麥冬成人（體質(zhì)量以50 kg 計，下同）每日安全服用量為10 660 g，為2020年版《中國藥典（一部）》規(guī)定用量的888 倍。以多效唑每日允許攝入量5 mg 計，含糖型顆粒樣品每日攝入量為0.015 mg，無糖型顆粒樣品為0.001 9 mg，膠囊劑樣品為0.001 mg，含片樣品為0.000 7 mg。

綜上所述，該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于檢測玄麥甘桔制劑中多效唑的殘留量。樣品中多效唑的每日攝入量遠(yuǎn)低于每日允許攝入量。從此方面看，樣品中檢出多效唑成分對人體的危害風(fēng)險較低，但藥品具有特殊性，多效唑在體內(nèi)的具體作用機制尚不明確，是否存在與各藥味中化學(xué)成分間相互反應(yīng)有待進(jìn)一步考證。