魚腥草素鈉對脂多糖誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7炎性反應(yīng)的抑制作用*

胡學(xué)洋，黃 鵬，吳陳亮

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012； 2. 江蘇省南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇南通226133； 3. 上海歐米尼醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203）

巨噬細(xì)胞是機體內(nèi)重要的炎性細(xì)胞，其通過參與炎性反應(yīng)的啟動，分泌大量的炎性介質(zhì)和炎性因子，促炎因子的過量表達會進一步增強和放大炎性反應(yīng)，在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。魚腥草為三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，在我國南方多有種植，《中國藥典》記載其有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的作用［3］。成分中以魚腥草揮發(fā)油的藥用活性價值較高［4］，其有效成分主要為魚腥草素，但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。目前使用的主要是魚腥草素和亞硫酸氫鈉的加合物魚腥草素鈉（SH），該化合物保留了魚腥草素的主要藥理活性，且比魚腥草素更穩(wěn)定［5-6］。SH（分子式為C12H23NaO5S）為白色的針狀結(jié)晶性粉末，在水或乙醇中微溶，在氯仿或苯中幾乎不溶。SH 有抗炎［7］、抗菌［8］、止咳平喘［9］、抗過敏［9］、抗腫瘤［10］作用，但其對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 的作用及機制尚不明確。因此，本研究中采用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞以復(fù)制體外炎癥模型，探討SH 抑制炎性反應(yīng)的作用機制，為SH 的應(yīng)用與開發(fā)提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：BL310/BL21S 型分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，精度為0.01 mg）；HF100 型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；CMax Plus 型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；HR/ T16MM 型高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；PowerPac 型電泳儀/轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；Focus 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（杭州申花科技有限公司）。

試藥：SH（湖北諾納科技有限公司，批號為2022082502）；LPS（美國Sigma 公司，批號為L2630）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號為KGM12800 - 500）；噻唑藍（MTT，美國Sigma 公司，批號為M2003）；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為S0023）；前列腺素E2（PGE2）檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號為JM-02345M2）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（批號為RK00027），白細(xì)胞介素6（IL - 6）檢測試劑盒（批號為RK00008），均購自武漢愛博泰克公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體、Rabbit β -Actin（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BA0362，81115-1-RR）；核因子-κB（NF-κB）P65 抗體（美國proteintech 公司，批號為10745 - 1 - AP）；NF - κB - P - P65抗體、P - IκB - α 抗體（美國Zen - Bio 公司，批號分別為310052，R24671）；環(huán)氧合酶2（COX - 2）抗體（美國Abcan 公司，批號為ab32510）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（美國Perhor公司，批號為PH70013）；胎牛血清（美國Excell Bio公司，批號為12J079）。

細(xì)胞系：小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7（南京普皓生物技術(shù)有限公司，批號為778194）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：取RAW264.7 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DEME 高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～4天傳代1次。

NO水平：取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個/mL，以每孔2 mL 加入6 孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為空白對照組（等體積培養(yǎng)基）、模型組（等體積培養(yǎng)基）及SH 低、中、高劑量組（1.25，5，10 μmol/L）。以含不同濃度SH 的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2 h，加入LPS置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用酶標(biāo)儀測定540 nm 波長的吸光度（A）值并計算NO含量。

TNF - α，IL - 6，PGE2水平：取對數(shù)生長期RAW 264.7 細(xì)胞，同法分組、給藥、培養(yǎng)。采用酶鏈免疫吸附法檢測TNF-α，IL-6，PGE2水平。

iNOS、COX-2及NF-κB通路相關(guān)蛋白表達水平：取對數(shù)生長期RAW264.7 細(xì)胞，同法分組、給藥、培養(yǎng)，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 試劑盒對樣品蛋白進行定量。采用Western blot 法檢測iNOS，COX - 2，β - actin 及NF - κB P65，NF - κB - P - P65，P - IκB - α，β - actin蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 9 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NO 水平

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞NO 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SH 中、高劑量組細(xì)胞NO 水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖1。

注：①- ⑤分別為空白對照組、模型組及SH 低、中、高劑量組。與①組比較，#P ＜ 0.01；與②組比較，*P ＜ 0.01。圖2 至圖4同。圖1 細(xì)胞NO水平（±s，n=3）Note：①-⑤refers to blank control group，model group，SH low-，medium - and high - dose groups，respectively. Compared with those in the ①，#P ＜0.01；compared with those in the ②，*P ＜ 0.01（for Fig.1-4）.Fig.1 NO level in cells（±s，n=3）

2.2 細(xì)胞TNF-α，IL-6，PGE2 水平

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-6 及PGE2水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SH 低、中、高劑量組細(xì)胞TNF - α，IL - 6，PGE2表達水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 細(xì)胞TNF-α，IL-6，PGE2水平（±s，n=3）A.TNF-α B.IL-6 C.PGE2Fig.2 TNF-α，IL-6 and PGE2 levels in cells（±s，n=3）A.TNF-α B.IL-6 C.PGE2

2.3 細(xì)胞iNOS 和COX-2 蛋白表達水平

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞iNOS、COX - 2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SH中、高劑量組細(xì)胞iNOS蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），SH 低、中、高劑量組細(xì)胞COX-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖3。

A. 電泳圖 B.iNOS數(shù)據(jù)統(tǒng)計 C.COX-2數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖3 細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達水平（±s，n=3）A.Electropherogram of protein expression B.Data statistics of iNOS expression C.Data statistics of COX-2 expressionFig.3 Expression levels of iNOS and COX-2 proteins in cells（±s，n=3）

2.4 細(xì)胞NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達水平

與空白對照組比較，模型組細(xì)胞NF - κB - P -P65、P-IκB-α 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，SH 低、中、高劑量組細(xì)胞NF - κB - P -P65和P-IκB-α蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4。

A. 電泳圖 B.NF-κB-P-P65數(shù)據(jù)統(tǒng)計 C.P-IκB-α數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖4 細(xì)胞NF-κB信號通路蛋白表達水平（±s，n=3）A.Electropherogram of protein expression B.Data statistics of NF-κB-P-P65 expression B.Data statistics of P-IκB-α expressionFig.4 Expression levels of NF-κB signaling pathway proteins in cells（±s，n=3）

3 討論

預(yù)試驗中采用MTT 法，檢測了SH 對細(xì)胞活性的影響，結(jié)果SH濃度在0～20 μmol/L之間對RAW264.7細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，故本研究中選擇SH 濃度為1.25，5，10 μmol/L 開展后續(xù)實驗。在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生過量的PGE2，NO，TNF-α，IL-6等炎性介質(zhì)，繼而引發(fā)一系列炎性反應(yīng)。NO 為重要的炎性介質(zhì)，過量NO 能損傷DNA，抑制線粒體中的呼吸作用，進而促進炎性反應(yīng)發(fā)生［11-12］。PGE2為重要促炎因子，其與受體結(jié)合后可加速炎性反應(yīng)［13］。促炎因子TNF-α是早期炎癥的標(biāo)志物，能介導(dǎo)炎癥、免疫反應(yīng)及組織損傷，多種炎癥相關(guān)疾病均呈現(xiàn)高水平TNF-α［14］。IL- 6 為免疫調(diào)節(jié)因子，與TNF- α 共同參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，為反映機體炎癥程度的重要指標(biāo)［14］。本研究中，SH 可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO，PGE2，TNF-α，IL-6 的分泌，說明其抗炎作用與抑制炎性因子和炎性介質(zhì)的分泌有密切聯(lián)系。

iNOS 酶是NO 合成酶，它的表達直接決定NO 釋放量［15］。COX - 2 酶可催化花生四烯酸生成前列腺素前體，在正常細(xì)胞中幾乎不表達，當(dāng)受到外源刺激后表達水平會迅速升高，是反映炎癥嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志酶［16］。本研究中，RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，iNOS和COX - 2 蛋白表達水平顯著升高，SH 能顯著降低iNOS和COX-2蛋白的表達水平，該結(jié)果與細(xì)胞上清液中測定的NO 和PGE2水平變化相一致，說明SH 可通過抑制iNOS和COX-2蛋白的表達抑制炎性因子分泌。

NF - κB 通路作為經(jīng)典的炎癥通路，在正常情況下，IκB - α 與NF - κB 以無活性復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到LPS 刺激時，IκB-α 會迅速磷酸化降解，NF - κB 亞單位從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥［16-18］。本研究中，RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，細(xì)胞中P-IκB-α 蛋白的表達水平顯著升高，但經(jīng)SH處理后，P-IκB-α蛋白表達水平的降低呈劑量依賴性，可能的機制是IκB-α與P65 二聚體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)水解，使NF-κB 亞單位解離出來，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，調(diào)控基因表達，產(chǎn)生有關(guān)炎性因子和介質(zhì)，而SH 進入細(xì)胞后可能抑制了IκB - α 與P65 二聚體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)水解，蛋白磷酸化水平顯著下降，從而抑制了NF - κB 信號通路的表達，進而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，SH可抑制細(xì)胞炎性因子的分泌，其機制與抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表達及調(diào)控NF-κB通路有關(guān)。