青蒿琥酯對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)氣道上皮屏障損傷的防護(hù)作用及機(jī)制*

宋 韻，王 斌

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）為死亡率較高的慢性肺病，且?guī)沓林氐纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。COPD 的主要危險(xiǎn)因素是吸入有毒物質(zhì)和病原體，如香煙煙霧（CS），其可引起肺部持續(xù)的炎性反應(yīng)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)氣道和肺組織重塑［2］。氣道上皮細(xì)胞連接形成的上皮屏障是抵御外界有害因素的第一道防線，上皮屏障的破壞使上皮下層組織暴露于有害物質(zhì)，是導(dǎo)致COPD 發(fā)生、發(fā)展的初始因素［3］。青蒿琥酯（ART）為半合成水溶性青蒿素衍生物，臨床主要用于抗瘧治療，具有高藥理活性和低毒性。研究發(fā)現(xiàn)，ART 可顯著抑制炎性反應(yīng)［4］及癌細(xì)胞增殖［5］，預(yù)防缺血和再灌注損傷［6］，抑制新型冠狀病毒（SARS - CoV - 2）復(fù)制［7］。治療呼吸系統(tǒng)疾病時(shí)，ART可與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用，通過抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖緩解氣道壁重塑［8］，能抑制肺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的表達(dá)從而抑制肺癌進(jìn)展［9］，而EGFR 也是CS破壞氣道上皮緊密連接和引起屏障功能損害的靶點(diǎn)蛋白之一［10］。但尚未見ART 在保護(hù)氣道上皮屏障中的作用和機(jī)制的報(bào)道。在此，以CSE 刺激的人支氣管上皮細(xì)胞和CS 誘導(dǎo)的小鼠為研究模型，探討ART 對(duì)氣道上皮屏障損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制，以期為ART 用于COPD治療提供新的基礎(chǔ)理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：1379型細(xì)胞生物安全柜、3111型二氧化碳培養(yǎng)箱、Multifuge X1R 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Spark 型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；DS-Ri2型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ERS-2 V-Ohmmeter型電阻測(cè)量?jī)x（美國(guó)Millipore公司）；DK-420型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

試藥：ART（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)為A3731）；腫瘤壞死因子- α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)分別為JL10208，JL14113）；角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，1×角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑（美國(guó)ScienCell 公司，批號(hào)分別為2111，2162）；青霉素和鏈霉素（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)為15140148）；Annexin V - FITC/PI 試劑盒（美國(guó)BD 公司，貨號(hào)為556547）；ZO - 1（貨號(hào)為13663）、E-cadherin（貨號(hào)為14472）、EGFR（貨號(hào)為4757）、GAPDH（貨號(hào)為97166S）一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（兔抗、鼠抗，貨號(hào)分別為8889S，4408S），均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；紅雙喜香煙（硬盒，焦油量11 mg，烤煙型，上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司）。

動(dòng)物：SPF 級(jí)BALB/ c 小鼠25 只，6～8 周齡，雌雄兼用，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2022-0004。飼養(yǎng)于溫度25 ℃、相對(duì)濕度60%、自然光源的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。

細(xì)胞：人支氣管上皮細(xì)胞（HBEC，美國(guó)ScienCell 公司，貨號(hào)為ZQ0001）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CSE 的制備［8］：以10 mL 培養(yǎng)基吸收1 支香煙的煙霧，調(diào)培養(yǎng)基pH 至7.4，經(jīng)0.22 μm 過濾器進(jìn)行無菌過濾，將濾液定義為100%CSE。進(jìn)一步以培養(yǎng)基稀釋至所需體積分?jǐn)?shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)：取HBEC 細(xì)胞，加入含100 U/ mL 青霉素、100 μg/ mL 鏈霉素和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度超過90%時(shí)，進(jìn)行消化傳代；新傳代細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，取細(xì)胞融合度約60%時(shí)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

分組：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（A 組），CSE 組（B 組），ART低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組）。A 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；B 組細(xì)胞予2.5%CSE 處理24 h；C1組、C2組、C3組細(xì)胞同B 組操作，在予2.5% CSE 刺激前1 h 加入ART 共孵育，ART終濃度分別為1，10，100 μmol/L，培養(yǎng)24 h。

觀察指標(biāo)：1）氣道上皮屏障功能。使用表面電阻測(cè)量?jī)x檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞層的完整性，計(jì)算跨上皮電阻（TEER），TEER（Ω/cm2）=（R樣本-R空白）× 有效膜面積（cm2）。重復(fù)操作3 次（下同）。2）炎性因子。取各組細(xì)胞適量，置離心管中，4 ℃下以13 000g離心10 min，分離，得上清液，采用ELISA 法測(cè)定細(xì)胞IL - 6 和TNF -α 水平，按試劑盒說明書操作。3）細(xì)胞凋亡率。各組細(xì)胞消化懸浮后，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)并計(jì)算凋亡率。4）蛋白質(zhì)免疫印跡分析。采用Western blot 法，使用RIPA 裂解細(xì)胞，提取總蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS - PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入EGFR、ZO-1、E-cadherin、GAPDH一抗（1∶1 000，V/V）在4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶1 000，V/V）室溫孵育1 h，用顯色液顯色，成像，使用Image J軟件分析。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

分組和建模：將25 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（a 組，等體積生理鹽水），CS組（b組，等體積生理鹽水），ART低、中、高劑量組（c1組、c2組、c3組，ART 25，50，100 mg/kg），各5 只。將小鼠持續(xù)暴露于4 支香煙的煙霧中1 h，每天2 次，持續(xù)8 周，以建立氣道上皮屏障損傷小鼠模型［3］。對(duì)照小鼠暴露于空氣中。各組小鼠每日首次CS 刺激前1 h腹腔注射相應(yīng)藥物或生理鹽水。

觀察指標(biāo)：小鼠左肺用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片（4 μm 厚），加入EGFR，ZO - 1，E - cadherin，GAPDH 一抗（1∶200，V/V）在4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶5 000，V/V）室溫孵育，然后進(jìn)行細(xì)胞核的DAB 染色和蘇木精再染色，脫水和密封后，顯微鏡下觀察分析上述兩指標(biāo)表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎性因子

與A 組比較，B 組細(xì)胞TNF - α 和IL - 6 水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C2組、C3組細(xì)胞兩指標(biāo)水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1。

A.IL - 6 B.TNF - α注：與A組比較，##P ＜0.01；與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖2至圖4同。圖1 細(xì)胞炎性因子水平A.IL-6 B.TNF-αNote：Compared with those in the group A，##P ＜ 0.01；Compared with those in the group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Fig.1 - 4）.Fig.1 Levels of cellular inflammatory factors

2.2 細(xì)胞凋亡情況

與A組比較，B組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2。

a. 流式細(xì)胞圖 b. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖2 細(xì)胞凋亡情況a.Results of flow cytometry detection b.Data statisticsFig.2 Cell apoptosis

2.3 氣道上皮屏障功能

與A組比較，B組細(xì)胞TEER值顯著降低（P＜0.01）；與B組比較，C2組、C3組細(xì)胞TEER值顯著升高（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 氣道上皮細(xì)胞連接完整情況Fig.3 Integrity of airway epithelial cell junction

2.4 氣道上皮細(xì)胞表面連接蛋白和EGFR 表達(dá)水平

與A 組比較，B 組細(xì)胞ZO - 1 和E - cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），EGFR 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C2組、C3組細(xì)胞ZO - 1 和E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，EGFR表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖4。

A. 蛋白電泳圖 B. 相對(duì)表達(dá)量圖4 氣道上皮細(xì)胞胞間連接蛋白和EGFR表達(dá)A.Protein electropherogram B.Relative expression levelFig.4 Expression of intercellular junction proteins and EGFR in airway epithelial cells

2.5 免疫組化

與a組比較，b組小鼠的肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，肺組織中E-cadherin 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，而EGFR表達(dá)水平顯著升高；與b組比較，c1組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯改善，E - cadherin 和ZO - 1 蛋白表達(dá)明顯增加，而EGFR表達(dá)明顯減少。詳見圖5。

圖5 小鼠肺組織胞間連接蛋白和EGFR表達(dá)Fig.5 Expression of intercellular junction proteins and EGFR in lung tissue

3 討論

COPD的主要誘因之一是長(zhǎng)期直接或間接接觸CS。CS 由氣體和顆粒組成，其中含7 000 多種化學(xué)物質(zhì)，如氧化氣體和重金屬，以及至少70 種致癌物質(zhì)，是導(dǎo)致COPD 肺功能不可逆損害的最重要原因［3］。已有研究表明，CSE 誘導(dǎo)支氣管上皮中屏障功能相關(guān)蛋白ZO - 1、Occludin 或E - cadherin 的分解［11-12］，是COPD 發(fā)生發(fā)展的初始機(jī)制，本研究結(jié)果與之一致。上皮屏障的結(jié)構(gòu)和功能損害是呼吸道慢性炎癥的常見標(biāo)志，其中TNF-α和IL - 6 被認(rèn)為是CSE 所致持續(xù)炎性反應(yīng)和氣道屏障功能障礙的重要炎性因子，COPD患者靜脈血中TNF-α和IL-6的濃度與其疾病嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)［13］。本研究結(jié)果也顯示，CSE所致持續(xù)炎性反應(yīng)會(huì)引起上皮細(xì)胞凋亡，這可能也是導(dǎo)致氣道上皮屏障功能障礙的直接原因。

ART 因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值、安全性為廣泛的藥理作用受到關(guān)注。大量體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ART 可通過多種途徑改善實(shí)驗(yàn)性過敏性氣道炎癥、氣道平滑肌細(xì)胞增殖、氧化性肺損傷和肥大細(xì)胞脫顆粒［14］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)ART 干預(yù)后支氣管上皮細(xì)胞TNF - α 和IL - 6 水平顯著下降，細(xì)胞凋亡比例降低，同時(shí)改善了胞間連結(jié)蛋白表達(dá)水平和TEER 值，證實(shí)了ART 的抗炎、抗凋亡和保護(hù)氣道上皮屏障的作用。類似研究發(fā)現(xiàn)，ART對(duì)CS誘導(dǎo)的肺損傷具有抗炎和抗氧化特性，可能通過抑制PI3K 和p42/ 22 MAPK 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，具有治療COPD的潛力［15］。

有研究認(rèn)為，CS通過激活EGFR-ERK1/2信號(hào)通路，誘導(dǎo)支氣管上皮的損傷及ZO-1 蛋白的分解，從而損害氣道上皮屏障功能［16］，本研究結(jié)果與之一致。EGFR 在COPD 的病程進(jìn)展中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者的氣道中，異常升高的EGFR 活性增加了PI3K / Akt 介導(dǎo)的FoxO3A 磷酸化，從而促進(jìn)趨化因子的表達(dá)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)［17］。上皮細(xì)胞中的ADAM17/ EGFR 軸作為傳入管腔應(yīng)力信號(hào)的受體，負(fù)責(zé)將信號(hào)傳遞給鄰近細(xì)胞，是控制肺損傷和炎癥的重要機(jī)制［18］。本研究在細(xì)胞和動(dòng)物層面證實(shí)，ART 干預(yù)均能顯著抑制EGFR表達(dá)，推測(cè)ART具有保護(hù)氣道上皮屏障的藥理活性，其作用可能通過抑制EGFR表達(dá)介導(dǎo)。

綜上所述，本研究中通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，ART 能抑制CSE 誘導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)和氣道上皮細(xì)胞凋亡，防護(hù)CS所致氣道上皮屏障損傷，其作用機(jī)制可能與抑制EGFR表達(dá)有關(guān)。