低分子肝素鈉聯(lián)合醋酸地塞米松基于PAR-2/TRPV1信號(hào)通路治療小鼠瘙癢模型的有效性

李仰琪,趙曉嵐,梁艷華,柯婭楠,沈秀玲,葉興東

瘙癢是一種可使人產(chǎn)生不快的主觀癥狀,易引發(fā)搔抓欲望,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年臨床發(fā)現(xiàn)瘙癢的外周敏化機(jī)制主要是組胺依賴及非組胺依賴性的瘙癢信號(hào)通路,其中蛋白酶激活受體2(PAR-2)途徑可介導(dǎo)瘙癢,瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(TRPV1)是該途徑的下游信號(hào)。有研究表明,非組胺依賴性瘙癢神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)與TRPV1或TRPA1耦聯(lián)神經(jīng)通路有關(guān)[1]。TRPV1的初級(jí)傳入C纖維的子集可根據(jù)受體的表達(dá)與瘙癢原敏感性分為3組[2-4]。TRPV1作為各刺激的整合器,在瘙癢、疼痛及皮膚神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-6]。本研究基于PAR-2/TRPV1信號(hào)通路探討低分子肝素鈉聯(lián)合醋酸地塞米松治療小鼠瘙癢模型的有效性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 于選取6周齡C57小鼠48只,體質(zhì)量(25±5)g,在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),晝夜12 h∶12 h,均衡飲食,自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只制成干皮癥(AEW)慢性瘙癢小鼠模型,剩余24只制成DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型。將AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組、地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組,每組6只。

1.2 建模與干預(yù)方法 小鼠AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)[7-8]。治療方法：模型對(duì)照組僅在小鼠脫毛部位給予0.9%氯化鈉溶液;地塞米松組在小鼠脫毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏(本院自制)0.1 g;肝素組在小鼠脫毛部位涂抹低分子肝素鈉軟膏(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn))0.1 g;聯(lián)合用藥組在小鼠脫毛部位涂抹醋酸地塞米松乳膏、低分子肝素鈉軟膏各0.1 g。各組小鼠用藥頻率均為2次/d,持續(xù)干預(yù)7 d。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 (1)瘙癢次數(shù)：于干預(yù)前、干預(yù)7 d后,分別將各組小鼠置于聚丙烯樹脂玻璃盒子內(nèi),在安靜環(huán)境下用攝像機(jī)記錄小鼠1 h內(nèi)對(duì)頸背部的抓撓次數(shù),測(cè)試當(dāng)天選取3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)記錄,取平均值。(2)PAR-2、TRPV1蛋白表達(dá)量：干預(yù)7 d后,觀察小鼠皮損、抓撓情況,而后采取頸椎脫臼法處死所有小鼠,取小鼠造模區(qū)皮膚,提取蛋白并根據(jù)BCA法進(jìn)行蛋白定量,待抗體孵育完成清洗,行ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行目的蛋白條帶灰度分析,采用Western blotting檢測(cè)PAR-2、TRPV1蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 瘙癢次數(shù)比較 在AEW慢性瘙癢、DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,干預(yù)前,4組小鼠瘙癢次數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)7 d后,聯(lián)合用藥組、肝素組、地塞米松組小鼠瘙癢次數(shù)均少于模型對(duì)照組,且聯(lián)合用藥組小鼠瘙癢次數(shù)少于肝素組、地塞米松組(P<0.05),見表1。

表1 4組小鼠模型干預(yù)前后瘙癢次數(shù)比較次,n=6)

2.2 PAR-2、TRPV1蛋白表達(dá)量比較 干預(yù)7 d后,在AEW慢性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05);地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組PAR-2蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05)。干預(yù)7 d后,在DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1、PAR-2蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組(P<0.05),見表2。

表2 4組小鼠模型干預(yù)后TRPV1、PAR-2蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

急性瘙癢提示環(huán)境存在有害物質(zhì),如昆蟲、有毒植物或其他刺激物,同時(shí)激發(fā)抓撓,以清除瘙癢原并減輕瘙癢感。慢性瘙癢則可能是一種伴隨皮膚或系統(tǒng)病變的免疫異常表現(xiàn),雖然多數(shù)瘙癢癥狀由組胺信號(hào)介導(dǎo),但還有其他神經(jīng)通路[9],如來自植物毛霉的針刺通過非組胺依賴途徑引起的強(qiáng)烈瘙癢[10-11]。此外,免疫細(xì)胞可釋放多種致癢原,引起瘙癢、銀屑病及濕疹等,而抗組胺藥物在治療瘙癢方面無效。大多數(shù)病理生理瘙癢癥對(duì)抗組胺藥物并不敏感,治療靶點(diǎn)尚未確定[12]。皮膚病、全身性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神疾病等均可導(dǎo)致瘙癢癥狀,常表現(xiàn)為急性或慢性形式(持續(xù)時(shí)間≥6周)。

慢性瘙癢的治療是臨床的一項(xiàng)挑戰(zhàn),中重度瘙癢患者的生活質(zhì)量顯著降低。而瘙癢的潛在生理學(xué)非常復(fù)雜,包括角質(zhì)形成細(xì)胞和感覺神經(jīng)元等以及某些免疫細(xì)胞的浸潤。有研究表明,角質(zhì)層細(xì)胞、神經(jīng)纖維與各種免疫細(xì)胞(如角質(zhì)形成細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)之間存在顯著影響,皮膚和脊髓神經(jīng)元或不同免疫細(xì)胞上受體之間的相互作用對(duì)瘙癢傳播起著重要作用。

TRPV1廣泛分布于皮膚重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞的細(xì)胞膜上,包括角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞,以及樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞等功能細(xì)胞的細(xì)胞膜上,多種炎性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展與內(nèi)外源性刺激介導(dǎo)的TRPV1活化密切相關(guān),該受體活化可進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)肽或促炎性遞質(zhì)釋放,該通道的活化或阻斷在慢性炎性皮膚病治療中的靶點(diǎn)作用也日益凸顯。TRPV1是瘙癢信號(hào)傳導(dǎo)的重要分子。背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對(duì)PAR-2和5-羥色胺的反應(yīng)大于對(duì)組胺的反應(yīng),提示慢性干性皮膚的瘙癢神經(jīng)信號(hào)途徑可能是內(nèi)源性激活劑的釋放促使PAR-2和5-羥色胺受體2A激活,致敏發(fā)送瘙癢信號(hào)的神經(jīng)元,加重瘙癢癥狀,此過程并不依賴組胺的釋放。相關(guān)研究證實(shí),PAR-2神經(jīng)源性機(jī)制參與皮膚炎癥和瘙癢,TRPV1屬于瞬時(shí)受體電壓感受器家族成員之一,存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。目前已有研究證實(shí)PAR-2在外周神經(jīng)系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓及大腦中存在表達(dá),因此,PAR-2信號(hào)途徑也可刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊髓水平段的神經(jīng)肽釋放,CGRP受體和SP受體(NK1P)激活后,促使癢覺效應(yīng)直接傳達(dá)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。此外,神經(jīng)元表面的PAR-2活化后,神經(jīng)元發(fā)生以鈣離子為主的跨膜離子流動(dòng),細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變,TRPV1活性增強(qiáng),PAR-2與TRPV1以協(xié)同作用的方式相互影響,增強(qiáng)瘙癢感覺。

肝素是三磷酸肌醇(IP3)受體特異性拮抗劑,其中低分子肝素分子量小,易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)拮抗IP3受體,從而抑制PAR-2激活誘導(dǎo)的鈣離子濃度上升。本研究結(jié)果顯示,干預(yù)7 d后,在所有瘙癢小鼠模型中,聯(lián)合用藥組瘙癢次數(shù)少于肝素組、地塞米松組;在AEW慢性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組低于地塞米松組、肝素組,地塞米松組、肝素組、聯(lián)合用藥組PAR-2蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組更低于地塞米松組、肝素組;在DNFB過敏性皮炎急性瘙癢小鼠模型中,肝素組、聯(lián)合用藥組TRPV1、PAR-2蛋白表達(dá)量低于模型對(duì)照組,聯(lián)合用藥組更低于地塞米松組、肝素組,表明低分子肝素鈉與醋酸地塞米松均可明顯改善瘙癢小鼠皮膚瘙癢癥狀,且聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單一用藥,同時(shí)低分子肝素鈉可顯著降低小鼠皮膚PAR-2/TRPV1通路蛋白的表達(dá),且聯(lián)合醋酸地塞米松對(duì)該通路的抑制效果更加顯著,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了低分子肝素鈉聯(lián)合醋酸地塞米松可通過阻斷PAR-2/TRPV1信號(hào)通路改善瘙癢小鼠的瘙癢程度,PAR-2/TRPV1非組胺依賴通路可能是低分子肝素鈉發(fā)揮作用的重要機(jī)制。

綜上所述,低分子肝素鈉軟膏可通過阻斷PAR-2/TRPV1信號(hào)通路改善瘙癢小鼠的瘙癢癥狀,將其與醋酸地塞米松聯(lián)合治療對(duì)該通路的抑制效果更加顯著。隨著對(duì)PAR-2及TRPV1生物學(xué)功能的深刻認(rèn)識(shí),以及其在炎癥性瘙癢性皮膚病發(fā)病機(jī)制中的深入探討,研發(fā)更具有特異性的PAR-2或TRPV1拮抗肽應(yīng)用于瘙癢性皮膚病的治療終將成為可能。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。