低分子量硫酸軟骨素體外酵解特征及其對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

田偉功，王琳琳，杜茜茜，王立龍，艾春青，閆春紅，宋爽

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034）

腸道菌群由高度復(fù)雜和多樣化的微生物群落組成，參與有機(jī)體的各種生理功能，對有機(jī)體的健康至關(guān)重要[1]。此外，腸道菌群能夠降解多糖并代謝形成多種生物活性物質(zhì)，如短鏈脂肪酸等，通過促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等因子的水平，來保護(hù)腸道上皮細(xì)胞，從而改善腸道的屏障功能[2]。因此調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)腸道中短鏈脂肪酸生成，對保障腸道功能具有重要的意義。多糖作為腸道菌群中能量和營養(yǎng)的主要來源，具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[3]，其中多糖的分子量和聚合度是影響其調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)的可能因素，會直接或間接地影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、能量吸收以及免疫系統(tǒng)等機(jī)體反應(yīng)[4]，因此多項(xiàng)研究通過控制多糖降解的程度得到不同聚合度的降解片段來探究其益生活性的不同，例如，Li 等[5]用β-甘露聚糖酶降解桑葚多糖產(chǎn)生桑葚低聚糖，并發(fā)現(xiàn)桑葚低聚糖對鼠李糖乳桿菌的增殖效果更為顯著。李煜[6]對酶解和微波裂解方法制備的低分子量魔芋葡甘聚糖進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明低分子量的魔芋葡甘聚糖對乳桿菌屬生長有很好的促進(jìn)作用，可以看出經(jīng)過降解后得到的低分子量多糖的益生活性更強(qiáng)。

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是由交替的(1→3)-O-β-N-乙酰基半乳糖胺與(1→4)-O-β-葡萄糖醛酸重復(fù)單位連接而成，廣泛分布于動物軟骨中，是結(jié)締組織的重要組成部分[7]。研究證明硫酸軟骨素可通過促進(jìn)小鼠腸道有益菌的生長來調(diào)節(jié)胰島素的分泌[8]，但低分子量硫酸軟骨素（Low Molecular Weight Chondroitin Sulfate，LWCS）對其益生活性的影響研究較少。目前，常見的硫酸軟骨素降解方法包括物理降解法（超聲波降解、微波降解）、化學(xué)降解法（氧化降解、酸水解、酶法降解）等方式[9]。但是，酸水解法的反應(yīng)條件比較激烈，對多糖中的硫酸基團(tuán)破壞較大，影響產(chǎn)物活性[10]；酶法降解過程較復(fù)雜且生產(chǎn)成本高[11]；超聲波輔助降解、微波輔助降解等方法均對儀器設(shè)備有較高要求，大幅提高了多糖降解的成本[12,13]；由于氧化降解對硫酸基團(tuán)的破壞程度小[14]，因此非常適合用于制備低分子量硫酸化多糖。常見的芬頓氧化降解由于依賴金屬離子，后期脫除金屬離子操作較為繁瑣，還可能會造成環(huán)境的污染。光催化降解是一種高級氧化降解的方法，它可以利用光敏半導(dǎo)體材料在光輻射照射下產(chǎn)生·OH、O2-·等自由基[15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過6 h 光催化降解硫酸軟骨素分子量由55.49 ku 降至5.01 ku 左右，且硫酸基含量沒有顯著性變化[16]，降解產(chǎn)物的還原端多為葡萄糖醛酸或其衍生物阿拉伯糖醛酸，表明光催化反應(yīng)中自由基主要攻擊葡萄糖醛酸的糖苷鍵。但與芬頓氧化降解不同，光催化降解沒有在還原端生成二羧酸類。因此光催化降解是一種環(huán)保、低成本、高效且能夠保留硫酸基團(tuán)的降解硫酸軟骨素方法。

本研究通過光催化降解的方法得到低分子量硫酸軟骨素，并且基于體外發(fā)酵模型評價硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素對腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，為硫酸軟骨素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨硫酸軟骨素，武漢東康源生物有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純），美國Spectrum 公司；乙酸銨、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸（均為色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司；二硝基水楊酸（分析純），大連博諾有限公司；二甲基亞甲基藍(lán)（分析純），Sigma 股份有限公司；三羥甲基氨基甲（分析純），生工生物工程（上海）。

1.2 儀器與設(shè)備

光催化氙氣光源系統(tǒng)，北京中教金源科技有限公司；高效液相色譜儀，美國Waters 公司；LXQ 液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；厭氧工作站，英國ELECTROTEK 公司；pH 計，美國METTLER公司；CF16RX II 高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；高壓滅菌器，日本TOMY 公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tican 公司。

1.3 方法

1.3.1 低分子量硫酸軟骨素的制備

光催化反應(yīng)在光催化氙氣光源系統(tǒng)中進(jìn)行。在室溫下，將TiO2（0.5 g）加入均勻的硫酸軟骨素溶液（5 mg/mL）中。打開氙燈，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液（終濃度為400 mmol/L）反應(yīng)6 h，離心除去TiO2，取上清液透析除去H2O2，之后透析后的溶液濃縮凍干得到低分子量硫酸軟骨素粉末。

1.3.2 相對分子質(zhì)量的測定

相對分子質(zhì)量的測定采用高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）。使用TSK-gel G5000PWxl（7.5 mm×30.0 cm）凝膠色譜柱，柱溫為30 ℃，配備示差折光檢測器。流動相為0.1 mol/L 乙酸銨緩沖液（pH 值6.0），流速為0.4 mL/min。以葡聚糖（相對分子質(zhì)量分別為5、12、25、50、150、410 和670 ku）為標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品用流動相配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液或取200 μL 質(zhì)量濃度5 mg/mL 的發(fā)酵上清液，使用0.22 μm 聚醚砜水系濾頭（天津津騰）過濾后采用HPGPC 分析，進(jìn)樣量為10 μL，測定其色譜峰的保留時間。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各個樣品的相對分子質(zhì)量。

1.3.3 多糖體外酵解

1.3.3.1 主要培養(yǎng)基和緩沖液

基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基（1 L）：2 g 蛋白胨、2 g 酵母提取物、0.02 g 血紅素、0.5 g L-半胱氨酸、0.5 g 膽酸鹽、0.1 g NaCl、0.04 g K2HPO4、0.04 g KH2PO4、0.01 g MgSO4·7H2O、0.01 g CaCl2·6H2O、2 g NaHCO3、1 mL刃天青（1%，m/V）、2 mL Tween-80和10 μL vitamin K1，調(diào)節(jié)pH 值到6.5。

改性磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：0.8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1 g/L Na2HPO4、0.2 g/L KH2PO4、0.5 g/L 半胱氨酸鹽酸鹽、0.04 g/L 刃天青，調(diào)pH 值（6.6±0.1）。121 ℃滅菌15 min。

1.3.3.2 人體糞便接種液的制備

收集4 名志愿者（2 男2 女，攝入正常的飲食，沒有消化疾病，至少3 個月沒有服用抗生素）的新鮮糞便，將糞便樣品與改性PBS 配制成10%（m/V）的混合糞便菌液，上述操作在厭氧工作站內(nèi)完成。得到的混合物離心5 min（500 r/min）后，取上清，作為糞便菌群接種液。

1.3.3.3 糞便發(fā)酵液接種

將1.2 mL 的10%（m/V）的混合糞便菌液與10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合放入培養(yǎng)瓶中，混合后于厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h（37 ℃）。不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照組（Blank），硫酸軟骨素為唯一碳源作為CS 組（CS），低分子量硫酸軟骨素為唯一碳源作為LWCS組（LWCS），培養(yǎng)0、6、12、24、48 h 后分別取樣，10 000 r/min 離心10 min 后用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 pH、相對含量、還原糖含量的測定

使用pH 計測定發(fā)酵0、6、12、24、48 h 后不同組發(fā)酵上清液的pH 值。使用二甲基亞甲基藍(lán)法（Dimethylmethylene Blue，DMMB）法[17]分析發(fā)酵0 h 和48 h 的發(fā)酵上清液中的相對含量，分別使用硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。使用二硝基水楊酸法（3,5-Dinitrosalicylic Acid，DNS）[18]檢測發(fā)酵0、6、12、24、48 h 的發(fā)酵上清液還原糖的含量，使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5 短鏈脂肪酸的測定

1.3.5.1 混標(biāo)的制備

配制含有1.0 mg/mL 的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，隨后稀釋為5、50、100、200、300、400 和500 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時加入100 μL 的內(nèi)標(biāo)（2-乙基丁酸，1.0 mg/mL）。

1.3.5.2 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取500 μL發(fā)酵液上清加入20 μL稀硫酸酸化（50%，V/V），加入900 μL 乙醚和100 μL 的內(nèi)標(biāo)（2-乙基丁酸），渦旋振蕩后在-20 ℃下靜置一段時間，4 ℃離心（12 000 r/min）。收集上清液并加入250 mg無水Na2SO4，充分渦旋，4 ℃離心（12 000 r/min），取上清液使用0.22 μm尼龍66有機(jī)相濾頭（天津津騰）過濾，供上機(jī)分析。

1.3.5.3 氣相色譜質(zhì)譜條件

使用儀器配有 HP-INNOWAX 氣相色譜柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）的Agilent 7890B-5977B GC/MSD 系統(tǒng)。色譜條件：進(jìn)樣量1 μL，初始溫度為80 ℃，升溫速度為40 ℃/min，最終溫度為230 ℃，保持3 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（Electron Impact Ion，EI），離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，傳輸管溫度250 ℃，在70 eV 電壓下以m/z30～300 的全掃描模式下進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

1.3.6 人體糞便微生物群分析

微生物多樣性測序由百邁客生物科技有限公司完成。用TGuide S96 磁珠法糞便基因組DNA 提取試劑盒完成核酸的提取，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。對基因組DNA 中的16S rRNA基因V3-V4 區(qū)擴(kuò)增，引物選用806R 和338F。文庫通過Qsep-400 方法進(jìn)行質(zhì)檢，滿足如下指標(biāo)即可上機(jī)檢測。對于構(gòu)建好的文庫使用illumina novaseq 6000（novaseq 6000，illumina）進(jìn)行上機(jī)測序。測序完成后，根據(jù)通用標(biāo)準(zhǔn)對原始序列進(jìn)行篩選。所有的結(jié)果都基于序列讀取和操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），腸道菌群主成分分析、花瓣圖、聚類分析、菌群的相對豐度和熱圖等在網(wǎng)站上操作得出（https://international.biocloud.net/zh/article/index）。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8.3 進(jìn)行作圖。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。兩組或兩個樣本間的比較使用Student'st-test檢驗(yàn)。檢驗(yàn)三組之間的差異使用單因素方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）中Duncan's range檢驗(yàn)。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 腸道菌群利用情況分析

首先利用光催化降解的方法降解硫酸軟骨素，在降解時間為0 h、6 h 時測定樣品的分子質(zhì)量。如圖1所示，隨著降解時間的延長，色譜峰明顯向右偏移，說明光催化降解能夠使硫酸軟骨素分子質(zhì)量顯著下降。硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素分子質(zhì)量分別為88.42 ku 和4.48 ku。

圖1 硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素的高效凝膠滲透色譜圖Fig. 1 HPGPCof chondroitin sulfate (CS) and low molecular weight chondroitin sulfate (LWCS)

然后利用體外發(fā)酵模型分析評估腸道菌群的利用情況。使用HPGPC 法分析發(fā)酵上清液中分子量的變化情況，通過使用空白發(fā)酵液作為對照且對比發(fā)酵起點(diǎn)和發(fā)酵終點(diǎn)（圖2a），發(fā)酵后的色譜圖顯示硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素的峰面積減少，保留時間發(fā)生后移。進(jìn)一步使用DMMB 法檢測兩者在發(fā)酵上清液中含量發(fā)現(xiàn)（圖2b）經(jīng)過48 h 厭氧發(fā)酵后，兩者含量均顯著降低。圖2c 為整個發(fā)酵過程中pH 值的變化，發(fā)酵期間Blank 組呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，而CS 組和LWCS 組pH 值在0～24 h 一直顯著降低。然而，發(fā)酵24 h 后，CS 組的pH 值顯著升高，LWCS組的pH 值仍保持在較低水平。圖2d 顯示在發(fā)酵過程中CS 組和LWCS 組的還原糖含量，在0～6 h 期間分別從 3.21 mg/mL 和 5.56 mg/mL 顯著增加至3.44 mg/mL 和5.96 mg/mL，然后在6～48 h 期間顯著降低至1.62 mg/mL 和3.79 mg/mL。

圖2 在體外發(fā)酵中分子量（a）、多糖相對利用率（b）、pH（c）和還原糖含量（d）的變化Fig. 2 Changes in molecular weight (a),relative utilization of polysaccharide (b),pH (c) and reducing sugar content (d) in vitro fermentation

上述結(jié)果顯示發(fā)酵48 h 后，發(fā)酵液上清中的硫酸軟骨素、低分子量硫酸軟骨以及還原糖含量下降，相對分子質(zhì)量發(fā)生了變化。證明腸道菌群能夠降解利用硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素，并且均會降低發(fā)酵液中的pH 值，而低分子量硫酸軟骨素可以維持較長時間的酸性環(huán)境，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生和微生物菌群的變化都與pH 值的變化相關(guān)[19]，因此低分子量硫酸軟骨素更有利于有益菌的生長和短鏈脂肪酸的生成。同時在發(fā)酵過程中還原糖含量的變化同鼠尾藻多糖[20]和菠蘿蜜多糖[21]的體外發(fā)酵結(jié)果一致，都呈現(xiàn)出先增高后降低的變化，這可能是由于菌群降解多糖過程中會首先破壞糖苷鍵釋放更多的還原端，使還原糖含量增高，而后期這些短鏈還原糖又被菌群逐步分解利用。而王鑫純等[22]報道野皂莢多糖在體外發(fā)酵過程中的還原糖濃度持續(xù)下降，而降解后野皂莢多糖中酵解液中的還原糖先降低再增高，之后又降低，推測這與腸道菌群優(yōu)先利用寡糖并分泌降解酶有關(guān)。

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 多樣性分析

利用IlluminaNovaseq 6000 平臺對體外發(fā)酵樣品中細(xì)菌16S rRNA V3-V4 區(qū)域進(jìn)行高通量測序，研究不同分子量硫酸軟骨素對腸道菌群的影響。在Alpha多樣性指數(shù)分析中（表1），Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)用于評估腸道微生物群的豐富度，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)代表腸道微生物群的多樣性。結(jié)果表明，CS 組Chao1、Ace 指數(shù)顯著低于Blank 組，Shannon、Simpson 指數(shù)顯著高于Blank 組，表明硫酸軟骨素降低了腸道微生物群的豐富性而增加了其多樣性。LWCS 組的Chao1、Ace 指數(shù)與Blank 組和CS 組均沒有顯著性差異，但Shannon、Simpson 指數(shù)顯著高于Blank 組和CS 組，表明低分子量硫酸軟骨素不會豐富腸道微生物群，但會使腸道微生物群多樣性顯著增加。但Liu 等[23]研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素對腸道微生物總體多樣性沒有顯著影響，而Tuncil 等[24]將硫酸軟骨素作為唯一碳源，發(fā)現(xiàn)不同志愿者糞便樣本中的Shannon 多樣性指數(shù)不同，而這可能與志愿者的個體差異、不同來源的硫酸軟骨素以及小鼠性別等有關(guān)[25]。主坐標(biāo)分析（PCoA）評分圖用于表示來自不同樣品的腸道菌群組成的差異性或相似性[26]，如圖3 所示，同一組樣品之間聚集在一起而不同組之間都存在明顯差異，表明不同分子量硫酸軟骨素能夠?qū)航Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用，但調(diào)控結(jié)果存在差異。

表1 不同組間腸道微生物的Alpha 多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis of gut microbiota in different groups

圖3 不同組間腸道菌群的PCoA 分析圖Fig. 3 Structural modulation of gut microbiotain different groups

2.2.2 腸道微生物相對豐度顯著差異分析

為了研究不同分子量硫酸軟骨素對人體糞便菌群組成的影響，分析了不同組之間的菌群在門和屬的水平上的差異。如圖4 所示，在門水平上，腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）組成。與Blank 組相比，CS 組和LWCS 組均顯著增加了Bacteroidetes 相對豐度，F(xiàn)irmicutes 和Proteobacteria 的相對豐度以及Firmicutes/Bacteroidetes 的比例均顯著減少。值得注意的是，與硫酸軟骨素相比，低分子量硫酸軟骨素促進(jìn)Bacteroidetes 增殖的作用更強(qiáng)。

圖4 不同組間腸道菌群在門水平上的影響Fig. 4 The effects of different groups on gut microbiota at the phylum level

據(jù)報道，F(xiàn)irmicutes 和Bacteroidetes 均含有編碼硫酸軟骨素利用位點(diǎn)和水解酶的基因，且Bacteroidetes基因組具有高度特異性，能夠?qū)⑵浣到獯x從而降低腸道菌群中有害菌群的相對豐度[2]，且低聚糖更容易被Bacteroidetes 利用[27]。而雖然由于Firmicutes 基因組中編碼位點(diǎn)較少，同時Bacteroidetes 會爭奪周圍的可用營養(yǎng)物質(zhì)[28]，從而導(dǎo)致Firmicutes 減少。因此，推測糞便菌群中的Bacteroidetes 能夠優(yōu)先利用硫酸軟骨素導(dǎo)致相對豐度增加，且更容易利用分子量更低的硫酸軟骨素，從而降低Firmicutes/Bacteroidetes 的比值。有研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素改變腸道菌群中的Bacteroidetes 和Firmicutes 的豐度及比例，最終改善了高脂飲食引發(fā)的炎癥反應(yīng)[29,30]。表明不同分子量硫酸軟骨素均可通過調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善宿主代謝健康。Proteobacteria 中含有大腸桿菌等多種有害病原體，通常被認(rèn)為是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志，Proteobacteria 增加會導(dǎo)致人類許多疾病的發(fā)生[31]。研究顯示硫酸軟骨素可以顯著降低小鼠體內(nèi)Proteobacteria 的豐度而發(fā)揮其抗炎活性[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明不同分子量硫酸軟骨素均可以通過抑制Proteobacteria 增殖，具有改善宿主腸道健康的潛力。

為了進(jìn)一步確定不同分子量硫酸軟骨素之間有顯著差異的特定細(xì)菌類型，圖5 展示了體外發(fā)酵后的物種豐度前15 的菌屬。相對于Blank 組，發(fā)酵后CS 組和LWCS 組的擬桿菌屬（Bacteroides）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、巨單胞菌屬（Megamonas）顯著增加，從毛單胞菌屬（Comamonas）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、毛螺菌科 UCG_004（Lachnospiraceae_UCG_004 ）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜膽菌屬（Bilophila）顯著降低。與CS 組相比，LWCS 組顯著降低了埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、毛螺菌科 UCG-004（Lachnospiraceae_UCG_004 ）、鏈球菌屬（Streptococcus），顯著增加了Lachnoclostridium菌屬、嗜膽菌屬（Bilophila）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）的豐度?；谖⑸飳偎降南鄬?，使用LEfSe分析（LDA＞4）進(jìn)一步分析各個樣品之間的差異（圖6）。CS 組和LWCS 組分別促進(jìn)了糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris）和吉氏擬桿菌（Parabacteroides merdae）的富集，LWCS 組的擬桿菌綱（Bacteroidetes）細(xì)菌、坦納菌科（Tannerellaceae）細(xì)菌和Parabacteroides細(xì)菌（圖6）相對含量遠(yuǎn)高于CS 組。而CS 組的Escherichia-Shigella相對含量高于LWCS 組。

圖5 屬水平的細(xì)菌相對豐度Fig. 5 Relative abundance of gut microbiota at the genus level

圖6 CS 組和LWCS 組微生物群的LEfSe 分析（LDA＞4）Fig. 6 LEfSe analysis of microbial composition in CS and LWCS groups (LDA＞4)

Bacteroides屬和Parabacteroides屬微生物能夠降解多種復(fù)雜碳水化合物，是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)者[32-34]。其中Bacteroides作為人類腸道中的最豐富的細(xì)菌屬，有助于維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定[28]。但在缺乏多糖的情況下，Bacteroides會破壞腸道上的黏液蛋白，從而導(dǎo)致腸道炎癥[25]。而硫酸軟骨素可以被Bacteroides編碼的軟骨素酶裂解為不飽和二糖，經(jīng)胞內(nèi)硫酸酯酶脫硫后，被胞內(nèi)葡萄糖醛酸酶分解成單糖利用[35]，起到保護(hù)腸道屏障作用[23]。Parabacteroides在機(jī)體中可以產(chǎn)生細(xì)菌素防御外來微生物侵襲[36]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了CS 組和LWCS 組中主要菌群Bacteroides、Parabacteroides的豐度增加，而LWCS 組的腸道菌群經(jīng)過厭氧發(fā)酵后在菌中檢測到更多的Parabacteroides細(xì)菌，因此，Parabacteroides細(xì)菌可能是腸道菌群中降解利用低分子量硫酸軟骨素的關(guān)鍵細(xì)菌。Streptococcus、Bilophila和Escherichia-Shigella等是潛在的致病菌[37,38]，CS 組和LWCS 組促進(jìn)了有益菌的增長，而有益菌及產(chǎn)物所具有的抗菌活性可以對于腸道內(nèi)病原菌發(fā)揮消滅作用，使腸道生態(tài)平衡得以重新建立[39]，因此，Streptococcus、Bilophila和Escherichia-Shigella等致病菌的豐度顯著降低。Liu 等[23]也發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素抑制了有害菌的增殖并緩解了應(yīng)激小鼠中的腸道炎癥。綜上所述，與硫酸軟骨素相比，低分子量硫酸軟骨素能夠更好的促進(jìn)有益菌并且抑制致病菌的生長。

2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物分析

短鏈脂肪酸是腸道菌群發(fā)酵硫酸軟骨素等多糖產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物之一[23]，也是評價益生作用的重要指標(biāo)之一。本文測定了發(fā)酵后不同組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸的含量，從而了解腸道菌群的代謝情況。結(jié)果如圖7 所示，乙酸、丙酸和丁酸是主要的代謝產(chǎn)物，與CS 組相比，LWCS組能夠顯著地促進(jìn)乙酸、丙酸和總短鏈脂肪酸水平，分別是CS 組的1.15、1.03 和1.09 倍，顯著降低了戊酸的水平。而CS 組的異丁酸和異戊酸的濃度顯著低于Blank 組和LWCS 組。

圖7 短鏈脂肪酸含量測定結(jié)果Fig. 7 Results of shortchain fatty acids content determination

乙酸和丙酸主要由Bacteroidetes 產(chǎn)生[40]，而丁酸的合成途徑較多，除了Firmicutes 產(chǎn)生，腸道微生物還可以利用乳酸和乙酸來合成[41]。乙酸在短鏈脂肪酸中占比最多，可通過神經(jīng)系統(tǒng)來降低食欲，進(jìn)而發(fā)揮抗肥胖作用。丙酸可參與并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減少促炎因子的形成，作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的直接能量來源，具有抗炎特性，并且能夠調(diào)控腸黏膜上皮細(xì)胞等維持腸道穩(wěn)態(tài)[42]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明不同分子量硫酸軟骨素均能顯著促進(jìn)Bacteroidetes 的富集，因此產(chǎn)生了較多的乙酸、丙酸和丁酸。這與眾多結(jié)果研究一致，硫酸軟骨素可以通過促進(jìn)短鏈脂肪酸的生成發(fā)揮其益生作用，例如，Liu 等[23]研究顯示硫酸軟骨素增加了小鼠糞便中總短鏈脂肪酸和丁酸水平，其中丁酸水平增加了2倍以上，并改善了應(yīng)激小鼠的炎癥水平。Yu 等[43]研究發(fā)現(xiàn)來源于羅非魚頭的硫酸軟骨素調(diào)節(jié)了小鼠的腸道菌群平衡并顯著增加小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸的含量緩解高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝。不同的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示戊酸含量顯著減少，猜測可能是不同分子量硫酸軟骨素不能被少量戊酸產(chǎn)生菌，例如埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii），巨型球菌種（Megasphaerasp）等利用[42]。異丁酸、異戊酸是腸道細(xì)菌發(fā)酵蛋白質(zhì)或氨基酸中的支鏈氨基酸產(chǎn)生的特征產(chǎn)物，常作為一些疾病的標(biāo)記物[44]。與Blank 組相比，CS 組可以顯著抑制異丁酸和異戊酸的產(chǎn)生，而LWCS 組對異丁酸的抑制作用減弱且不會抑制異戊酸的生成。但由于戊酸、異丁酸、異戊酸含量在總短鏈脂肪酸中占比較少，猜測可能對機(jī)體產(chǎn)生的影響較為有限。因此，上述結(jié)果說明低分子量硫酸軟骨素不僅能夠更好的調(diào)控菌群的組成結(jié)構(gòu)，而且能夠影響短鏈脂肪酸的含量。

但研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素的分子量和硫酸化程度可對腸道菌群的調(diào)控結(jié)果造成影響，腸道菌群需要產(chǎn)生不同的酶來利用不同的硫酸軟骨素異構(gòu)體[45]，進(jìn)而影響其豐度。此外，不同的模型也會影響其降解速率及其干預(yù)效果[24]。因此，硫酸軟骨素的益生活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

本文使用體外發(fā)酵模型和16S rRNA 基因測序技術(shù)評價了硫酸軟骨素和低分子量硫酸軟骨素體外酵解特征及其對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，低分子量硫酸軟骨素具有更好的益生特性，不僅可以為腸道菌群提供較長時間的酸性環(huán)境，并且能夠更好的調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，具體表現(xiàn)在低分子量硫酸軟骨素顯著提高了腸道菌群多樣性,與硫酸軟骨素組相比，Shannon指數(shù)增加了1.58%，Simpson 數(shù)增加了2.17%，擬桿菌門比例顯著提高了8.08%，并顯著增加擬桿菌屬，副桿菌屬的相對含量，顯著降低了致病菌埃希氏-志賀氏菌屬的相對含量（P＜0.05），從而顯著促進(jìn)乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸生成（P＜0.05），最終，總短鏈脂肪酸含量提高了69.76%，而硫酸軟骨素組僅為55.19%。因此表明降低硫酸軟骨素的分子量能夠提高腸道菌群的益生作用，為硫酸軟骨素的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。