基于Nrf2 和NLRP3 探討辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟的保護作用

李晨雯，柏珺，趙力，楊思昱，羅雅俊，張青碧

（西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境健康效應(yīng)及風(fēng)險評估瀘州市重點實驗室，四川瀘州 646000）

酒精所造成的疾病是世界各國都重視的公共衛(wèi)生問題，我國歸因于飲酒的疾病負擔(dān)仍舊沉重，2019 年因飲酒致死的人數(shù)是1990 年的1.44 倍，且飲酒是我國居民死亡的第三位危險行為因素[1]，長期飲酒會引起機體代謝失衡，甚至酒精中毒。研究表明，長期飲酒可通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝臟損傷[2]。雖然藥物可以緩解酒精毒性，但也會對機體造成一定副作用[3]。因此，探討天然植物提取物緩解酒精毒性的作用成為了研究熱點[4]。

辣木（Moringa oleifera）是辣木屬多年生熱帶落葉喬木，因生長快速、富有營養(yǎng)且功能多樣而具有很高的經(jīng)濟價值，被稱為“奇跡之樹”。已有研究發(fā)現(xiàn)辣木籽具有抗氧化、保肝護肝、抗炎、抗醉等多種作用[5-7]。藥理學(xué)研究表明，辣木籽提取物能夠促進體內(nèi)酒精代謝，在減少酒精吸收的同時提高乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性[8]，從源頭上減少酒精的傷害。體外研究發(fā)現(xiàn)辣木籽在抗氧化方面有一定應(yīng)用前景[9]，同時其具有抗炎、保肝等作用，從機制上分析其對慢性酒精性肝損傷可能具有良好的療效。目前在對于辣木籽提取物的研究中，有研究提示辣木籽提取物可有效緩解酒精所致的線蟲運動障礙[3]，另外，辣木籽對酒精和四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有緩解作用[10]。但目前辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷的緩解作用機制仍不清楚。

核轉(zhuǎn)錄 NF-E2 相關(guān)因子 2（Nuclear Factor Crythroid-related Factor 2，Nrf2）是抗氧化體系上游的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著上百種抗氧化相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達[11]。許多天然藥物可通過調(diào)控Nrf2 來保護肝細胞免受酒精所致的氧化損傷[12,13]，有研究表明辣木籽可激活Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄因子血紅素加氧酶1（HemeOxygenase 1，HO-1）[14]，提示辣木籽可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路激活機體的氧化防御系統(tǒng)。而炎性小體是位于細胞內(nèi)的多蛋白復(fù)合體，參與機體的炎癥反應(yīng)，而炎癥小體的核心成分為核苷酸結(jié)合寡聚化合物結(jié)構(gòu)域樣受體（Nucleotide-binding Oligomerization Domain Like Receptors，NLRPs）家族蛋白，核苷酸結(jié)合寡聚化合物結(jié)構(gòu)域樣受體3（NACHT-LRR-PYD-containing Proteins 3 Inflammasome，NLRP3）是NLRPs 家族中的一員，具有啟動炎癥反應(yīng)的作用[15]。研究表明，酒精性肝損傷患者的肝臟樣本中NLRP3 表達增加[16]，提示NLRP3 可能與酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。有研究證實，辣木籽可減少阿霉素介導(dǎo)的心臟毒性臨床前模型的促炎生物標(biāo)志物如NLRP3[17]。這一結(jié)果提示辣木籽可通過抑制NLRP3 的表達進而抑制炎癥的發(fā)生。因此我們推測，辣木籽可能通過調(diào)節(jié)Nrf2 及NLRP3的表達來緩解酒精所致的慢性肝損傷。本實驗使用乙醇熱浸法對辣木籽進行提取并將提取物用于慢性酒精性肝損傷小鼠，探索辣木籽提取物通過調(diào)節(jié)Nrf2 及NLRP3 對慢性酒精性肝損傷的影響，為辣木籽緩解慢性酒精性肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(川)2018-065），為6～8周齡Balb/C 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，動物飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，濕度50%±5%。

1.2 藥品與試劑

辣木籽，云南省昆明市；無水乙醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司；Lieber-DeCarli 酒精液體模型飼料[TP4032，飼料配比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：脂肪12%，蛋白質(zhì)18%，碳水化合物34%，酒精36%]、Lieber-DeCarli 酒精液體對照飼料[TP4032C，飼料配比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：脂肪12%，蛋白質(zhì)18%，碳水化合物70%]，南通特洛菲飼料有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Aminotransferase，AST）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒，上海橋社生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣木籽提取物的制備

辣木籽提取物的獲取參考湯興楠等[18]研究，選擇乙醇熱浸法，該方法辣木籽生物活性物質(zhì)的提取率較高，包括總苷、總黃酮和總酚。該提取方法的最佳工藝條件：將干燥辣木籽研磨為粉末后過篩，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液按1:30 g/mL 料液比，70 ℃加熱提取，提取時間為2 h，提取2 次，用真空濾膜泵過濾提取物后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50 ℃真空濃縮過濾液，最后將濃縮液冷凍真空干燥后獲得固體提取物。用蒸餾水將終產(chǎn)物分別配制成5、10、15 mg/mL 的溶液，于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 Lieber-DeCarli 酒精液體飼料動物模型的建立

參考初君怡[16]的研究構(gòu)建小鼠慢性酒精性肝損傷模型。將60 只小鼠隨機分為以下6 組：A：空白對照組（CON group）；B：高劑量辣木籽提取物（15 mg/mL）對照組（HMo-CON group）；C：Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組（酒精造模組，L-D group）；D：低劑量辣木籽提取物（5 mg/mL）酒精造模組（LMo group）；E：中劑量辣木籽提取物（10 mg/mL）酒精造模組（MMo group）；F：高劑量辣木籽提取物（15 mg/mL）酒精造模組（HMo group）。A、B 組用不含酒精的液體飼料喂養(yǎng)，C、D、E、F 組用等體積Lieber-DeCarli 酒精液體飲料喂食，同時，B、F 組用15 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃，D 組用10 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃，E 組用5 mg/mL 辣木籽提取物按每天10 mL/kg 灌胃。連續(xù)喂養(yǎng)小鼠8 周，模擬慢性酒精性肝損傷模型，8 周末處死小鼠。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測

1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后采用眼球靜脈取血方式收集小鼠血液，將收集的血液置于2 mL 離心管中，血樣靜置30 min 后，4 000 r/min 離心15 min 后，取上清液并根據(jù)試劑盒說明書測定血清中AST、ALT 及炎癥因子IL-18、IL-1β的含量。

1.3.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取血后處死小鼠，剝離肝臟，將肝臟用冰生理鹽水漂洗、濾紙吸干水后，切取1 cm3的肝臟組織，用濾紙吸干血水，福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋后切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin Staining，HE），光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)改變。

1.3.5 肝臟中MDA、GSH 和SOD 的檢測

將1.3.4 中剩余肝臟組織分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩７盅b的各組肝臟組織稱取1 g放入玻璃勻漿管口剪碎，加入9 倍體積冷生理鹽水。低溫狀態(tài)下降肝臟組織充分研碎使組織勻漿化，低溫離心機離心3 000 r/min 離心15 min 取上清液，按試劑盒說明書進行操作測定MDA、GSH 和SOD 的含量。

1.3.6 Western blot 檢測肝臟中蛋白表達水平

稱取適量分裝的小鼠肝臟組織，加入4 ℃裂解緩沖液提取總蛋白。使用BCA 蛋白測定試劑盒進行蛋白濃度測定。將各樣品蛋白濃度調(diào)整至一致后，將等量蛋白加入提前配好的SDS-PAGE 凝膠上進行電泳，電泳完成后進行濕轉(zhuǎn)恒流轉(zhuǎn)膜，使蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將PVDF 膜浸入封閉液封閉90 min，封閉完成后將PVDF 膜放在加入相應(yīng)抗體的一抗稀釋液中，37 ℃恒溫滴膜孵育2 h 或4 ℃過夜。一抗孵育完畢后用TBST 清洗4 次，每次5 min；清洗完畢后將PVDF 膜放在二抗稀釋液中，37 ℃恒溫滴膜孵育1 h；孵育完畢后用TBST 清洗4 次，每次5 min；將PVDF 膜浸泡于ECL 發(fā)光液中，在凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用重復(fù)測量資料的方差分析和單因素方差分析，分析后兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟功能的影響

隨著肝細胞的破壞，肝損傷會導(dǎo)致血清學(xué)指標(biāo)的明顯改變，慢性酒精性肝損傷常表現(xiàn)為肝細胞壞死和各種肝功能損傷指標(biāo)均明顯高于正常動物。梁華峰等[19]的研究表明，采用血清AST、ALT、MDA、γ-GT、腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β能較為可靠的反映肝功能的變化。AST 和ALT 是臨床評估肝功能是否損傷的常用指標(biāo)[20]，在酒精性肝損傷的相關(guān)研究中可發(fā)現(xiàn)，酒精干預(yù)組均會引起模型動物血清中AST 及ALT的顯著升高[8,21]，表明酒精會造成動物出現(xiàn)一定程度的肝損傷。而在本研究中，通過小鼠血清學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），與對照組相比，高劑量辣木籽提取物對照組ALT 及AST 無明顯變化，表明在無酒精影響的情況下，辣木籽提取物對大鼠的肝功能影響不大；而Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組的ALT 及AST 的表達顯著升高，ALT 的表達增高至105.77 U/L，AST 的表達增長至210.37 U/L；與酒精造模組相比，給予不同濃度辣木籽提取物處理的酒精液體飼料喂食小鼠的血清中ALT 及AST 含量顯著降低，并與辣木籽提取物的濃度呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系，而高劑量的辣木籽提取物處理的酒精造模組的ALT 及AST 分別降至46.84 U/L 和71.68 U/L。這些結(jié)果提示辣木籽提取物能降低慢性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT 及AST 的含量。

圖1 各組血清ALT 及AST 含量Fig. 1 Contents of ALT and AST in serum of each group

3.2 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

為進一步判斷酒精對肝臟的損傷程度及辣木籽是否具有保肝護肝作用，我們對小鼠體質(zhì)量及肝臟進行稱量并計算肝臟指數(shù)。

式中：

L——肝臟指數(shù)，%；

m——肝臟質(zhì)量，g；

m0——小鼠體質(zhì)量，g。

如表1 所示，與對照組相比，慢性酒精暴露的小鼠體質(zhì)量明顯減輕，但肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)明顯增加。辣木籽提取物干預(yù)可明顯降低小鼠的肝臟指數(shù)，與Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組相比，辣木籽提取物中劑量和高劑量組小鼠的肝臟質(zhì)量指數(shù)分別降低了10.70%和23.20%。這一結(jié)果提示了辣木籽提取物可減輕酒精所致的小鼠慢性肝損傷。

表1 各組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 1 Liver weight and liver index of mice in each group

3.3 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響

為更進一步判斷酒精造模是否成功并確定辣木籽提取物對酒精造成的肝損傷有抑制作用，我們將肝臟組織進行了HE 染色并觀察其病理學(xué)變化。根據(jù)圖2的HE 染色結(jié)果顯示，對照組和高劑量辣木籽提取物對照組的小鼠肝細胞排列整齊、大小均一，細胞核呈圓形，界限清晰，分布在肝細胞中央，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組肝細胞排列紊亂，細胞質(zhì)疏松、腫脹，嗜酸性下降，細胞核固縮，形態(tài)不一，小靜脈周圍可見大量點狀或片狀壞死，肝細胞索排列紊亂，肝細胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯空泡狀。這一結(jié)果結(jié)合血清學(xué)指標(biāo)和肝臟指數(shù)的變化，提示采用本方法構(gòu)建慢性酒精性肝損傷小鼠模型成功。而在造模成功的慢性酒精性肝損傷大鼠肝組織中，辣木籽提取物隨著劑量的增加呈現(xiàn)劑量依賴性的肝保護作用，對酒精所致的肝細胞脂肪變性、炎性浸潤及壞死有不同程度的減輕。這一結(jié)果與張蕾等[10]的研究結(jié)果類似，提示辣木籽提取物在一定程度上抵抗長期攝入酒精所致的肝損傷。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色圖片F(xiàn)ig. 2 HE staining pictures of liver tissues of mice in each group

3.4 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

慢性酒精性肝損傷主要是由于乙醇在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)生有害的活性氧（ROS）等活性分子引發(fā)氧化應(yīng)激，抑制肝細胞的抗氧化能力并通過增加脂質(zhì)過氧化物的形成，使肝組織得不到足夠的氧導(dǎo)致肝細胞死亡，此外乙醇的代謝物乙醛也會通過脂質(zhì)的過氧化與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合而對肝產(chǎn)生毒害作用導(dǎo)致肝細胞死亡[22]。丙二醛（MDA）作為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物，其水平反映機體脂質(zhì)過氧化程度，可間接判斷細胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；超氧化物歧化酶（SOD）活力反映機體清除自由基能力；還原型谷胱甘肽（GSH）主要作用是清除自由基，防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，其水平也是衡量機體抗氧化能力的重要因素[23]。酒精可以導(dǎo)致SOD、GSH 等抗氧化物質(zhì)減少，進而導(dǎo)致MDA 的增加[4]，這一現(xiàn)象證明了氧化應(yīng)激可能是酒精造成肝臟損傷的重要因素。本實驗的研究結(jié)果表明（圖3），與對照組相比，給予酒精飲料進行慢性酒精性肝損傷造模后，小鼠肝臟中SOD 和GSH 的含量顯著降低，而MDA 含量顯著升高；而同時給予不同劑量辣木籽提取物后，SOD 和GSH 的含量較模型組均有不同程度的升高，MDA 有不同程度的降低。提示辣木籽提取物能調(diào)節(jié)慢性酒精性肝損傷模型小鼠肝臟中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到抗氧化作用，減輕酒精引起的氧化損傷。

圖3 各組肝臟MDA、SOD 和GSH 含量Fig. 3 Contents of MDA,SOD and GSH in liver of each group

3.5 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟炎癥因子表達的影響

炎癥在肝損傷中發(fā)揮重要作用，而酒精的代謝產(chǎn)物會增加腫瘤壞死因子、白介素IL-1、IL-6、IL-10 等炎性因子的產(chǎn)生進而影響甘油三酯的轉(zhuǎn)運而引起脂代謝紊亂[24]，進而加重肝損傷。有研究證實，長期飲酒后，肝細胞會合成大量炎性因子，進而導(dǎo)致肝細胞凋亡[25]。在關(guān)于肝臟疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-18 是重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，同時IL-1β能夠誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生眾多細胞因子，加速肝細胞凋亡，進一步加重肝細胞炎癥反應(yīng)，使肝細胞清理炎癥因子和內(nèi)毒素的能力下降[26]。因此，選擇IL-18 和IL-1β這兩個代表性的炎癥因子進行檢測。如圖4 所示，與對照組相比，Lieber-DeCarli 酒精液體飼料組的小鼠血清中IL-18 和IL-1β的含量顯著增加至105.77 pg/mL 和125.77 pg/mL，與對照組相比呈明顯增加（P＜0.05）。不同濃度的辣木籽提取物能夠有效降低酒精引起的IL-18 和IL-1β水平的升高，高劑量辣木籽提取物灌胃治療后分別降低至56.84 pg/mL 和52.84 pg/mL，與酒精造模組相比具有顯著差異（P＜0.05）。這些結(jié)果提示辣木籽提取物可能通過降低炎癥因子IL-18和IL-1β的分泌，起到抗炎作用。

圖4 各組血清中IL-18 和IL-1β 的含量Fig. 4 Contents of IL-18 and IL-1β in serum of each group

3.6 辣木籽提取物對慢性酒精性肝損傷小鼠相關(guān)氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

上述研究結(jié)果表明，酒精可通過氧化應(yīng)激和增加炎癥因子的表達造成肝損傷，而辣木籽提取物可通過增加抗氧化物質(zhì)含量以及降低炎癥因子的表達從而減緩酒精造成的肝損傷。有研究表明，Nrf2 作為抗氧化體系上游的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，Nrf2 可促進多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如GSH、HO-1等。而在酒精的作用下，Nrf2 蛋白表達被抑制，抑制抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激加重[27]。因此，為進一步探討辣木籽提取物調(diào)控抗氧化因子的分子機制，測定了抗氧化體系上游的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 及其下游轉(zhuǎn)錄因子HO-1 的蛋白表達。

如圖5 所示，慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟中Nrf2及HO-1 的蛋白表達水平顯著下降，表明慢性酒精暴露能顯著抑制肝臟Nrf2 的表達，進而抑制下游轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而影響肝組織中Nrf2 的抗氧化通路。不同劑量的辣木籽提取物能夠劑量依賴的提高Nrf2 蛋白水平，同時HO-1 蛋白的表達水平也顯著提高，提示在辣木籽提取物的作用下Nrf2 信號通路被有效激活，進而增強氧化防御系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激。在糖尿病腎病大鼠的研究中，辣木籽提取物可通過激活Nrf2/HO-1 通路保護患病大鼠的腎功能，證實了辣木籽提取物可以激活Nrf2/HO-1 信號通路對機體產(chǎn)生一定的保護作用[28]。同時Nrf2 也是NLRP3 炎癥小體的上游調(diào)控因子，其與NLRP3 炎癥小體的表達呈負相關(guān)，而NLRP3 炎癥小體可促進含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 1，Caspase-1）的產(chǎn)生，同時Caspase-1 涉及了IL-18 及IL-1β成熟與釋放[29,30]，提示NLRP3 的增加可加速炎癥反應(yīng)的進程。而辣木籽可減少心臟毒性臨床前模型中NLRP3 炎癥小體的表達[17]，因此我們推測，辣木籽可能也存在抑制炎癥因子的表達進而延緩酒精所致的慢性肝損傷進程，因此我們檢測了小鼠肝組織中的NLRP3 及Caspase-1 的蛋白表達水平。Western blot 結(jié)果顯示，慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟中NLRP3 的蛋白水平顯著增高，提示慢性酒精暴露促進肝臟NLRP3的表達，同時Caspase-1 在慢性酒精性肝損傷小鼠的肝臟組織中的表達水平也顯著升高，證明在酒精的長期作用下，小鼠肝臟組織中的NLRP3 炎性小體被激活并促進下游促炎因子Caspase-1 的表達，加重其肝臟損傷。而不同劑量的辣木籽提取物能夠劑量依賴性的降低NLRP3 蛋白表達，同時降低Caspase-1 的蛋白表達，提示辣木籽提取物可以通過降低NLRP3 的表達，降低下游促炎因子的表達，從而減輕慢性酒精暴露所致的小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)。在關(guān)于Nrf2 的研究中，有研究提示Nrf2 是NLRP3 炎性小體的上游調(diào)控因子，激活Nrf2 的基因表達可有效抑制NLRP3 炎性小體的表達[29]，在辣木籽提取物的作用下，Nrf2 的蛋白表達增高，其下游轉(zhuǎn)錄因子HO-1 的表達增高，激活肝臟組織中的氧化防御系統(tǒng)，同時減少NLRP3 炎性小體的表達，進而降低Caspase-1 蛋白的表達，減輕肝臟組織中的炎癥反應(yīng)，從而改善酒精所致的慢性肝損傷，表明辣木籽提取物對肝臟具有保護作用。

圖5 各組肝組織中相關(guān)蛋白表達Fig. 5 Protein expression of Nrf2 and NLRP3 in liver tissues of each group

3 結(jié)論

綜上所述，辣木籽提取物能夠降低慢性酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST 水平，呈現(xiàn)出對肝臟的保護作用。辣木籽提取物一方面通過激活Nrf2/HO-1 信號通路，提升肝臟抗氧化水平，降低脂質(zhì)過氧化水平；另一方面通過抑制NLRP3/Caspase-1 信號通路，減少IL-18、IL-1β的成熟與釋放，減輕炎癥反應(yīng)。因此辣木提取物可能通過促進小鼠肝臟的抗氧化及減少抗炎因子的表達來減輕酒精對小鼠肝臟的慢性損傷。