耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐消毒劑基因檢測及同源性分析

劉小麗,龔 林,王一梅,李美玲,李長風(fēng)

(1.武漢市疾病預(yù)防控制中心消毒與病媒生物防制所,湖北 武漢 430024; 2.武漢市疾病預(yù)防控制中心紀檢監(jiān)察室,湖北 武漢 430024; 3.武漢市醫(yī)院感染管理質(zhì)量控制中心,湖北 武漢 430024)

近年來,隨著碳青霉烯抗生素的廣泛應(yīng)用,耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)呈現(xiàn)出全球蔓延趨勢,已成為國內(nèi)外共同面臨的嚴峻挑戰(zhàn)[1]。2013年美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)將耐碳青霉烯酶類腸桿菌目細菌列為最高級別“緊迫威脅”。全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China Antimicrobial Resistance Surveillance System,CARSS)報告[2]結(jié)果顯示,我國CRKP檢出率由2014年的6.4%上升至2019年的10.9%,湖北省從4.4%上升至12.4%,上升速度較快。研究[3-5]表明,碳青霉烯酶敏感肺炎克雷伯菌感染致死率為20%～30%,而CRKP感染致死率為40%～70%,其直接后果是影響抗菌藥物治療效果,縮短新藥應(yīng)用與研發(fā)周期,延長患者治療周期和增加患者治療成本。消毒是切斷傳播途徑,阻斷CRKP傳播的重要措施之一,隨著各種消毒劑的廣泛使用甚至濫用,菌株選擇壓力加大,細菌對消毒劑的耐藥現(xiàn)象逐漸顯現(xiàn),目前常采用耐消毒劑基因檢出率判斷細菌對消毒劑的耐受性。消毒劑抗性增加與耐消毒劑基因相關(guān)。qacEΔ1編碼的外排系統(tǒng)廣泛存在于革蘭陰性菌中,檢出率與菌株對消毒劑敏感性下降呈現(xiàn)相關(guān)性[6]。肺炎克雷伯菌中cepA外排泵與對氯己定的敏感性降低有關(guān)[7],隨著氯己定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的增加,肺炎克雷伯菌cepA的表達也增加[8],且CRKP中攜帶耐消毒劑基因種類存在較大的地區(qū)差異性[7,9-10]。武漢地區(qū)缺乏相關(guān)的系統(tǒng)研究,為了解本地區(qū)不同醫(yī)院CRKP中耐藥消毒劑基因攜帶情況及同源性,為預(yù)防和控制其克隆傳播提供理論依據(jù)。本項目采用多中心研究,收集武漢地區(qū)3所醫(yī)院從臨床住院患者分離的CRKP菌株,采用MIC測定法進行藥敏試驗,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR,RT-PCR)檢測耐消毒劑的qacEΔ1和cepA基因攜帶情況,采用脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)對同時攜帶qacEΔ1和cepA基因的CRKP菌株進行同源性分析。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2018—2019年來自湖北省婦幼保健院(代碼Ⅰ)、武漢市第一醫(yī)院(代碼Ⅱ)和黃陂區(qū)人民醫(yī)院(代碼Ⅲ)3所三級醫(yī)院從臨床住院患者分離的62株非重復(fù)性CRKP。菌株入選標準:(1)為CRKP,即肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南或厄他培南其中的任何一種耐藥(亞胺培南或美羅培南MIC≥4 μg/mL,厄他培南MIC≥2 μg/mL);(2)少數(shù)患者住院期間多次培養(yǎng)出CRKP,則納入該患者首次培養(yǎng)的CRKP。3所醫(yī)院按照要求保存符合納入標準的CRKP菌株,由研究者單位每兩個月收集一次,集中保存于-80℃醫(yī)用冰箱中。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922,沙門氏菌H9812,購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。本研究通過武漢市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會批準(WHCDCIRB-K-2021038)。

1.2 主要儀器與試劑 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司,VITEK 2 Compact)、熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司,LightCycler 480)、脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司,CHEF Mapper XA)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司,ESSENTIAL V6)、細菌DNA提取試劑盒(北京康為世紀公司)、PCR反應(yīng)試劑盒(日本Takara公司)、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.4 耐消毒劑基因檢測 采用RT-PCR擴增CRKP中耐消毒劑的qacEΔ1、cepA基因,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中基因序列(qacEΔ1:DQ489717.1,cepA:AB073019.1),利用Primer Premier 5軟件合理設(shè)計qacEΔ1、cepA基因引物,見表1。參照細菌DNA提取試劑盒說明書提取DNA,設(shè)定PCR反應(yīng)條件,PCR反應(yīng)體系共20 μL,包括PCR反應(yīng)試劑mix 10 μL,上、下游引物各0.8 μL,探針0.4 μL,DNA模板1 μL,加雙蒸H2O補足體積。擴增條件為94℃,10 min;95℃ 10 s,58℃ 30 s,72℃ 1 s,40個循環(huán)。通過熒光擴增曲線觀察結(jié)果。

1.5 同源性分析 采用PFGE對同時攜帶qacEΔ1和cepA耐消毒劑基因的CRKP菌株進行同源性分析。參考中國疾病預(yù)防控制中心Pulse Net提供的PFGE相關(guān)標準化操作程序,調(diào)整相關(guān)電泳參數(shù)。試驗方法:菌株包埋入膠塊后,經(jīng)裂解和清洗,使用限制性內(nèi)切酶XbaI進行酶切,酶切后的膠塊置入0.5×TBE緩沖液和1%凝膠中電泳。電泳參數(shù)為電壓6 V/cm,夾角120度,溫度14℃,初始脈沖為6 s,最終脈沖為36 s,電泳時間18.5 h。電泳結(jié)束后,在凝膠成像儀上讀取圖像。

1.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用WHONET 5.6和SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用BioNumerics 7.6軟件對PFGE條帶進行聚類分析,用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group average method,UPGAM)和Dice系數(shù)分析菌株間的同源性,將具有80%以上相同條帶的菌株歸入同一型別[11]。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 62株CRKP來源于3所醫(yī)院13個不同的臨床科室,主要分布在重癥監(jiān)護病房(ICU),占77.42%,其中綜合ICU、兒科ICU(PICU)、神經(jīng)內(nèi)科ICU(NICU)分別占43.55%、22.58%、11.29%。按照年齡分組,老年人(≥65歲)組占比最高,為48.39%,其次為兒童(<14歲)組和成人(14～65歲)組,分別占30.64%、20.97%。62株CRKP主要來源于痰(占40.32%),其次為尿標本(占16.13%)。見表2。

表2 62株CRKP來源情況

2.2 藥敏試驗結(jié)果 62株CRKP均為多重耐藥菌,對阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松和厄他培南5種抗生素的耐藥率均為100%,對四環(huán)素的耐藥率最低(為35.48%),對臨床其他常見抗菌藥物也呈現(xiàn)高度耐藥,耐藥率為59.68%～98.39%。見表3。

表3 62株CRKP藥敏試驗結(jié)果

2.3 耐消毒劑基因檢出情況 62株CRKP,59株(95.16%)檢出耐消毒劑基因,其中40株(64.52%)qacEΔ1基因陽性,57株(91.94%)cepA基因陽性,38株(61.29%)同時檢出qacEΔ1和cepA基因。

2.4 同源性分析 PFGE結(jié)果顯示,38株同時檢出qacEΔ1和cepA的CRKP可分為A～K共11個型別。其中5個型別包含菌株數(shù)>1株,以E型為主,占42.11%(16株),分布在2所醫(yī)院的5個科室;C型占15.79%(6株),分布在1所醫(yī)院的3個科室;I型占10.53%(4株),分布于同一醫(yī)院的同一科室;H型和K型,均占7.89%(各3株),分布于同一醫(yī)院的不同科室。見圖1。

3 討論

本研究收集來自武漢地區(qū)3所三級醫(yī)院臨床住院患者分離的62株CRKP,首次分析本地區(qū)CRKP耐消毒劑基因的攜帶情況及耐消毒劑基因陽性菌株的同源性,是對國內(nèi)CRKP菌株多中心分子流行病學(xué)研究的有力補充。該研究收集的CRKP,主要來源于ICU,包括綜合ICU和?？艻CU,占77.42%,可能與ICU患者大多數(shù)免疫力低下、基礎(chǔ)性疾病較多、住院時間長、插管或機械通氣等侵入性操作較多有關(guān)。應(yīng)重點加強ICU抗菌藥物應(yīng)用的管理及醫(yī)院感染防控工作。62株CRKP,40.32%來源于痰標本,可能與人體的呼吸道與外界相通,自身免疫屏障作用較弱,再加上空氣污染等因素相關(guān),病原體更容易入侵定植,從而引起呼吸系統(tǒng)感染,提示臨床醫(yī)生應(yīng)重點加強患者的氣道管理。

本研究顯示,所有CRKP均為多重耐藥菌,對厄他培南的耐藥率達100%,對美羅培南、亞胺培南的耐藥率分別為96.77%、98.39%,對青霉素類、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺抑制劑復(fù)合物、頭孢菌素類、單環(huán)內(nèi)酰胺類和喹諾酮類等多種抗菌藥物表現(xiàn)出高水平耐藥,僅對四環(huán)素的耐藥率低于40%,說明武漢地區(qū)CRKP耐藥形勢十分嚴峻,與北京[12]、廣東[13]、江西[14]等地情況一致,應(yīng)加強細菌耐藥監(jiān)測,在抗菌藥物使用前進行病原學(xué)送檢及藥敏試驗,為臨床合理用藥提供參考。

目前研究顯示,肺炎克雷伯菌對各種消毒劑的耐受程度存在差異。李祥等[15]研究報道,部分CRKP已對“84”消毒劑產(chǎn)生了輕度的抗性,耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1與“84”消毒劑的抗性之間存在一定的相關(guān)性。qacEΔ1基因廣泛存在于革蘭陰性菌中,由整合子介導(dǎo),與消毒劑的低水平耐藥有關(guān)。Abuzaid等[8]研究報道,87.5%的肺炎克雷伯菌分離株攜帶cepA基因;Chen等[16]研究報道2016—2018年一所國內(nèi)三級醫(yī)院的36株CRKP,qacEΔ1陽性率為41.7%,cepA陽性率為80.6%;雷新云等[17]報道,肺炎克雷伯菌中qacEΔ1檢出率為62.50%。而在伊朗的一項研究[10]報道,肺炎克雷伯菌中qacEΔ1和cepA基因檢出率僅分別為30.6%、22.4%。本研究顯示61.29%的CRKP同時攜帶qacEΔ1和cepA基因,其中qacEΔ1和cepA基因檢出率分別為64.52%、91.94%,cepA基因檢出率遠高于qacEΔ1,提示qacEΔ1和cepA基因在醫(yī)療機構(gòu)分離的CRKP中廣泛存在,且攜帶cepA基因情況比攜帶qacEΔ1更為普遍。以上結(jié)果說明武漢地區(qū)CRKP菌株廣泛攜帶qacEΔ1和cepA耐消毒劑基因,因此,應(yīng)加強本地區(qū)耐消毒劑基因的監(jiān)測,建立消毒劑耐藥性監(jiān)測網(wǎng),定期監(jiān)測和報告耐藥情況,以期指導(dǎo)醫(yī)療機構(gòu)科學(xué)選擇消毒劑。

根據(jù)《醫(yī)院感染暴發(fā)控制指南》(WS/T 524—2016)[18]規(guī)定,醫(yī)院感染暴發(fā)是指在醫(yī)療機構(gòu)或其科室的患者中,短時間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例的現(xiàn)象。在實際工作中,由于大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)缺乏分子生物學(xué)監(jiān)測技術(shù)手段,很難確認“同種同源”,可能導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌株的流行或暴發(fā)。PFGE分型技術(shù)是分子分型中最常采用的方法,具有分辨力高、重復(fù)性好的特點,被認為是暴發(fā)感染溯源中分型的“金標準”[11]。本研究采用PFGE對38株同時攜帶qacEΔ1和cepA基因的CRKP進行同源性分析,結(jié)果顯示,38株CRKP可分為A～K共11個型,以E型為主(42.11%),主要分布于2所醫(yī)院的5個科室,一所醫(yī)院的ICU和康復(fù)科,另一所醫(yī)院的ICU、NICU和急診科,表明CRKP菌株存在跨醫(yī)院水平克隆傳播的可能。另外,C型、H型、K型主要分布在同一所醫(yī)院的幾個科室,提示CRKP菌株在3所醫(yī)院均存在不同科室間的克隆傳播。I型分布在一所醫(yī)院的同一科室,進一步分析發(fā)現(xiàn),此4例患者于2018年11月5—22日在PICU住院,1例患者因重癥肺炎于11月5日最早入住PICU,其余3例患者因膿毒癥、驚厥等疾病,分別于11月10日、15日、22日陸續(xù)入住該科室,結(jié)果提示CRKP存在同一科室內(nèi)不同患者間的克隆傳播,說明該院PICU可能存在CRKP醫(yī)院感染暴發(fā)。當醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)出現(xiàn)CRKP菌株后,如果缺乏及時有效的消毒措施,易于發(fā)生CRKP感染暴發(fā)流行。因此,當醫(yī)療機構(gòu)出現(xiàn)感染性病例,尤其是疑似醫(yī)院感染暴發(fā)時,應(yīng)提高警惕,及時收集菌株,采用PFGE等分子流行病學(xué)方法快速查明感染源,有助于從切斷感染途徑方面入手,控制多重耐藥菌的傳播[19]。

綜上所述,武漢地區(qū)CRKP耐藥形勢嚴峻,廣泛攜帶耐消毒劑基因,存在不同醫(yī)院、不同科室間的克隆傳播,應(yīng)采取有效的消毒隔離措施,科學(xué)使用消毒劑,切斷傳播途徑,從而有效控制醫(yī)院感染的發(fā)生。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。