龍虎交戰(zhàn)針?lè)ㄖ委熑毖阅X卒中臨床研究

許嘉隆，應(yīng)曉明，趙鈺琦，郭少卿

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005

缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的一種腦血管疾病，臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能受損、感覺(jué)異常、認(rèn)知能力下降、構(gòu)音困難等癥狀[1]。該病每年新發(fā)人數(shù)在1 300 萬(wàn)以上，我國(guó)每年新發(fā)人數(shù)為200 萬(wàn)左右，增速超過(guò)8%[2]。腦卒中的發(fā)病機(jī)制涉及缺血再灌注引起的炎癥反應(yīng)，及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)免疫功能紊亂[3]。西醫(yī)治療包括抗凝、溶栓、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等，急性期療效明顯，但對(duì)于恢復(fù)期的功能改善效果有限[4]。中醫(yī)針刺療法治療腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能障礙方面應(yīng)用廣泛[5]。龍虎交戰(zhàn)針?lè)ㄊ且环N特殊針刺手法，治療偏頭痛等神經(jīng)血管性疾病效果顯著[6]。但目前尚無(wú)治療缺血性腦卒中的報(bào)道。研究表明，miR-431 和miR-1247 與多種炎癥性及免疫功能障礙性疾病有關(guān)[7-8]，但對(duì)缺血性腦卒中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探索龍虎交戰(zhàn)針?lè)ㄖ委熑毖阅X卒中的療效，通過(guò)多因素Logistic 回歸和ROC 曲線分析miR-431 和miR-1247 對(duì)卒中發(fā)病及預(yù)后的影響，結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[9]制定。患者急性發(fā)??；伴局部神經(jīng)功能障礙，如單側(cè)面部或肢體麻木、感覺(jué)異?；蚍α?，也可出現(xiàn)全面的神經(jīng)功能受損；CT 或磁共振檢查發(fā)現(xiàn)病灶，或患者癥狀、體征持續(xù)24 h 以上；CT 或磁共振排除腦出血；排除非血管性病因。

1.2 辨證標(biāo)準(zhǔn)符合《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[10]中風(fēng)病氣虛血瘀證的診斷。偏身不遂，肢體萎軟，半側(cè)肢體麻木，舌體強(qiáng)硬，發(fā)音困難，四肢腫脹，面色?白，呼吸氣短，肢體無(wú)力，心慌自汗，舌質(zhì)淡紅、舌苔白，脈細(xì)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)及氣虛血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)；年齡≥18 歲；患者生命體征平穩(wěn)，能配合治療；精神及智力正常，可以與人交流。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重的心、肝、腎等臟器功能障礙；嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)疾??；惡性腫瘤；有針刺禁忌證；嚴(yán)重的凝血功能障礙；先天性關(guān)節(jié)畸形或肢體殘疾。

1.5 一般資料選取2020 年5 月—2022 年1 月就診于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院的缺血性腦卒中氣虛血瘀證患者98 例為研究對(duì)象，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和觀察組，每組49 例。2 組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。所有患者入組前均簽署知情同意書(shū)。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SY2021105）。

表1 2 組一般資料比較

2 治療方法

2 組患者均予以西醫(yī)常規(guī)治療，包括抗凝、抗血小板聚集、降脂、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等藥物。

2.1 對(duì)照組給予腦心通膠囊（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001，規(guī)格：0.4 g/粒），每次3 粒，每天3 次，口服，連續(xù)4 周。

2.2 觀察組在對(duì)照組治療方案的基礎(chǔ)上，采用龍虎交戰(zhàn)針刺法進(jìn)行治療。取穴：以百會(huì)、神庭、列缺、曲池、內(nèi)關(guān)、合谷為主穴，配穴包括風(fēng)池、風(fēng)府、大椎、氣海、關(guān)元、委中、三陰交、豐隆。針具：采用華佗牌一次性無(wú)菌針灸針，規(guī)格：0.25 mm×40 mm。龍虎交戰(zhàn)針?lè)ǎ哼M(jìn)針至皮下一定深度，用基本手法得氣，先捻針左轉(zhuǎn)，即拇指向前加力捻轉(zhuǎn)9 次，再捻針右轉(zhuǎn)，即拇指向后加力捻轉(zhuǎn)6 次。上述操作反復(fù)做6～9 次，以患者能忍受為限。捻針的角度在180 °～360 °之間，頻率為90～120 次/min 之間，施針后留針30 min。留針時(shí)間內(nèi)再行“龍虎交戰(zhàn)”手法2 次。每天治療1 次，連續(xù)4 周。

3 觀察指標(biāo)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.1 觀察指標(biāo)①美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分[11]。采用NIHSS 評(píng)價(jià)患者治療前后的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。NIHSS 包含精神狀態(tài)、肢體協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言交流能力、發(fā)音障礙、四肢遠(yuǎn)心端生理功能、視力、視野、皮膚感覺(jué)功能、忽視等11 個(gè)類(lèi)別，滿(mǎn)分為42 分，得分越高表示神經(jīng)系統(tǒng)癥狀越嚴(yán)重。②Fugal-Meyer 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估量表（FMA）評(píng)分[12]。采用FMA 評(píng)價(jià)患者治療前后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。FMA 包含雙上肢及雙下肢運(yùn)動(dòng)功能共2 個(gè)類(lèi)別，滿(mǎn)分為100 分，得分越高表示運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)得越好。③Barthel 指數(shù)（BI）評(píng)分[13]。采用BI 評(píng)價(jià)患者治療前后的日常生活能力恢復(fù)情況。BI 包含穿脫衣物、飲食、上廁所、梳妝打扮、控制小便、沐浴、平地走動(dòng)、移動(dòng)床椅、控制大便、爬樓梯等10 個(gè)類(lèi)別，滿(mǎn)分為100 分，得分越高表示日常生活能力恢復(fù)得越好。④血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血5 mL，3 000 ×g離心10 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)：AZ0367、AZ0389、AZ0451），采用450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)溶液吸光度，計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。⑤外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血5 mL 于EDTA 抗凝管中，搖勻，加入流式試管中，采用BD公司FACB CantoII 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞，并使用FACS DIVA 軟件分析結(jié)果。⑥血清miR-431 和miR-1247 表達(dá)水平。所有患者治療前后均抽取空腹靜脈血3 mL，3000×g離心10 min，提取上層血清。采用miRNA 提取分離試劑盒［凱杰生物工程（深圳）有限公司，貨號(hào)：217004］提取血清中miRNA，采用miRNA 的cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：MT0006）將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海生物工程公司合成，序列如下：miR-431 正向5'-ATGTCCGAC TAAAGTCGTCAAC-3'，反向5'-GCTGCCTACAGCG TGCTTC-3'；miR-1247 正向5'-GCAGCCTCTAGAA GTCGTCAGG-3'，反向5'-CTGGGCTACTGAAGGCT AG-3'；內(nèi)參采用U6 基因，正向5'-GACTGATGCT CTGGCCGA-3'，反向5'-GTCGGGTCGAAGCATGG-3'。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-431 和miR-1247 的表達(dá)量。⑦隨訪策略。所有患者治療結(jié)束后均隨訪1 年，采用門(mén)診、電話、微信等隨訪形式，每3 個(gè)月隨訪1 次，記錄每位患者腦卒中復(fù)發(fā)情況。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較，采用t檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布，用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 方法分析相關(guān)性，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。采用多因素Logistic 回歸分析，應(yīng)用逐步回歸法篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并計(jì)算比值比及95%置信區(qū)間。采用ROC 曲線計(jì)算曲線下面積（AUC），根據(jù)約登指數(shù)找出最佳臨界值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 療效標(biāo)準(zhǔn)與治療結(jié)果

4.1 療效標(biāo)準(zhǔn)參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[14]制定。痊愈：NIHSS 評(píng)分下降≥90%；顯效：46%≤NIHSS 評(píng)分下降≤89%；有效：18%≤NIHSS 評(píng)分下降≤45%；無(wú)效：NIHSS 評(píng)分降低＜18%。總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

4.2 2 組臨床療效比較見(jiàn)表2?？傆行视^察組95.92%，對(duì)照組75.51%，2 組臨床療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.257，P=0.041）。

表2 2 組臨床療效比較例（%）

4.3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評(píng)分比較見(jiàn)表3。治療前，2 組NIHSS、FMA、BI 評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，2 組NIHSS 評(píng)分均低于治療前，F(xiàn)MA 評(píng)分、BI評(píng)分均高于治療前，且觀察組NIHSS 評(píng)分低于對(duì)照組，F(xiàn)MA、BI 評(píng)分高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評(píng)分比較（）分

表3 2 組治療前后NIHSS、FMA、BI 評(píng)分比較（）分

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較見(jiàn)表4。治療前，2 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。治療后，觀察組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 組治療后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（）ng/L

表4 2 組治療前后IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（）ng/L

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平比較見(jiàn)表5。治療前，2 組CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，觀察組CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 組治療后CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平均高于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平比較（）%

表5 2 組治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平比較（）%

注：①與治療前比較，P＜0.05

組 別觀察組對(duì)照組t 值P例數(shù)49 49 CD3+CD4+CD8+治療后28.71±2.42①27.09±2.26①3.425＜0.001治療前58.04±3.34 57.36±3.18 1.032＞0.05治療后63.58±3.63①60.31±3.56①4.502＜0.001治療前30.72±3.35 30.10±2.88 0.982＞0.05治療后34.67±3.52①31.26±3.19①5.025＜0.001治療前26.17±2.14 26.63±2.37 1.008＞0.05

4.6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較見(jiàn)表6。治療前，2 組miR-431、miR-1247 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，觀察組miR-431、miR-1247 水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2 組治療后miR-431、miR-1247 水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較（）

表6 2 組治療前后miR-431、miR-1247 水平比較（）

注：①與治療前比較，P＜0.05

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4.7 血清miR-431、miR-1247 與炎癥及免疫指標(biāo)的相關(guān)性見(jiàn)表7。血清miR-431 水平與CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。血清miR-1247 水平與CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與IL-1β、IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表7 血清miR-431、miR-1247 與炎癥及免疫指標(biāo)的相關(guān)性

4.8 腦卒中復(fù)發(fā)的多因素Logistic 回歸分析見(jiàn)表8。單因素Logistic 回歸分析表明，miR-431、miR-1247、IL-1β、IL-6、TNF-α 可能與腦卒中復(fù)發(fā)有關(guān)（P＜0.05）；將上述因素納入多因素Logistic 回歸，發(fā)現(xiàn)miR-431、miR-1247、IL-1β、TNF-α 是腦卒中復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。

表8 腦卒中復(fù)發(fā)的單因素及多因素Logistic 回歸分析

4.9 血清miR-431 和miR-1247 預(yù)測(cè)腦卒中復(fù)發(fā)的ROC 曲線血清miR-431 預(yù)測(cè)腦卒中復(fù)發(fā)的AUC 為0.851，miR-1247 的AUC 為0.854。二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC 為0.942，高于單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC（P＜0.05）。各指標(biāo)的預(yù)測(cè)效能見(jiàn)表9，ROC 曲線見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-431 和miR-1247 預(yù)測(cè)腦卒中復(fù)發(fā)的ROC 曲線

表9 血清miR-431 和miR-1247 對(duì)腦卒中復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)效能

5 討論

缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的腦血管疾病，發(fā)病過(guò)程包括動(dòng)脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮功能受損，凝血機(jī)制障礙，導(dǎo)致腦細(xì)胞缺血壞死，引起運(yùn)動(dòng)障礙、失語(yǔ)等臨床癥狀[15]。其發(fā)生機(jī)制與腦血管缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，炎癥因子會(huì)引起血腦屏障損傷，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，從而加重腦卒中的病情[16]。卒中發(fā)生時(shí)，免疫系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可以識(shí)別壞死神經(jīng)細(xì)胞膜上的特定分子，改變血腦屏障通透性趨化T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞浸潤(rùn)，引起卒中后腦水腫，產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，加劇卒中進(jìn)展[17]。

缺血性腦卒中屬中醫(yī)中風(fēng)、撲擊、風(fēng)痱等疾病范疇，病因主要包括外感風(fēng)邪、內(nèi)生血瘀、痰濕阻滯、內(nèi)生火邪等[18]。其中氣虛血瘀證是該病的主要證型之一，病機(jī)為素體虛損、先天稟賦不足導(dǎo)致氣虛，使得氣血周流不暢，甚至血脈瘀阻，引起經(jīng)絡(luò)不通、腦絡(luò)失養(yǎng)，產(chǎn)生氣虛血瘀之證候，故而采用益氣活血化瘀之法治療卒中[19]。

龍虎交戰(zhàn)針?lè)ǎ督疳樫x》載：“龍虎交戰(zhàn)、左捻九而右捻六，是亦住痛之針?！饼埵侵笘|方青龍，圣人向南而立，故東方在左，指施針者向左捻轉(zhuǎn)針柄，為補(bǔ)法；虎是指西方白虎，向南而立時(shí)，西方在右位，指施針者向右捻轉(zhuǎn)針柄，為瀉法[20]。龍虎交戰(zhàn)是指通過(guò)針刺，操作上采用交替手法，產(chǎn)生補(bǔ)虛瀉實(shí)的作用，刺激體內(nèi)正氣與致病邪氣進(jìn)行龍爭(zhēng)虎斗，最終祛除病邪[21]?，F(xiàn)代研究表明，龍虎交戰(zhàn)針?lè)ú粌H有很好的止痛作用，也能顯著降低血清IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平，有效抑制炎癥反應(yīng)[22]。

本研究表明，觀察組總有效率比對(duì)照組高20.41%，這提示針刺能顯著提高缺血性腦卒中的臨床療效，改善運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量。卒中發(fā)生時(shí)，腦血管出現(xiàn)阻塞，血流量減少，尤其是一側(cè)腦部缺血缺氧時(shí)，使得患側(cè)腦的喚醒活動(dòng)下降，而對(duì)側(cè)腦的興奮性上升，從而形成健側(cè)對(duì)患側(cè)腦的抑制性增強(qiáng)，肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)受損，而針刺通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡，增加腦血流量等機(jī)制，從而恢復(fù)肢體運(yùn)動(dòng)功能[5]。本研究表明，治療后觀察組的IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均低于對(duì)照組，提示針刺能顯著抑制缺血性腦卒中的炎癥反應(yīng)。腦卒中后機(jī)體會(huì)激活Toll 樣受體4 通路，刺激周細(xì)胞釋放氧自由基、IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等炎性介質(zhì)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后觀察組的CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平均高于對(duì)照組，提示針刺能顯著改善缺血性腦卒中的免疫功能。卒中后機(jī)體通過(guò)炎癥小體中的模式識(shí)別受體及NOD 樣蛋白，增強(qiáng)血管通透性，引起免疫細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)，從而使得外周血中的T 淋巴細(xì)胞數(shù)量減少[23]。

miR-431 是一種具有調(diào)控功能的microRNA，能參與骨骼肌和肺泡等多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[24]。其水平升高能激活鈣調(diào)蛋白激酶Ⅳ信號(hào)通路，從而引起壞死性小腸結(jié)腸炎[8]。miR-1247 是另一種炎癥相關(guān)microRNA，可以通過(guò)靶向CCL16 調(diào)控肺炎巨噬細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)[25]。多因素回歸和ROC 曲線表明，miR-431、miR-1247 是腦卒中復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miR-431、miR-1247 二者聯(lián)合具有很好的預(yù)后價(jià)值。

本研究的優(yōu)點(diǎn)在于，采用多因素Logistic 回歸和ROC 曲線得出miR-431、miR-1247 對(duì)卒中復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究不足之處在于，僅納入了卒中恢復(fù)期患者，研究結(jié)果不能直接應(yīng)用于急性期患者；另外本研究?jī)H探討了氣虛血瘀證，結(jié)果用于其他證型需謹(jǐn)慎。今后將進(jìn)一步研究miR-431、miR-1247 對(duì)急性期患者的作用，并納入風(fēng)痰阻絡(luò)證等其他證型。

綜上所述，龍虎交戰(zhàn)針?lè)芨纳迫毖阅X卒中氣虛血瘀證患者運(yùn)動(dòng)功能和生活質(zhì)量，減輕炎癥反應(yīng)，提高免疫功能，降低血清miR-431、miR-1247水平，上述miRNA 是卒中復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，具有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值。