飼料及飼料添加劑中沙門氏菌的檢驗方法驗證研究

劉家麒

(上海微譜檢測認證有限公司,上海 200441)

隨著微生物檢測技術的不斷發(fā)展,對于沙門氏菌的檢測已有較多的檢測方法。如:免疫學、分子生物學等快速檢驗方法[1]、基于質譜分析的方法、基于光譜分析的方法等[2],相比之下,傳統技術也是目前運用和研究較多的,并在不斷的優(yōu)化[3]。對于每一種方法是否能夠適用于該實驗,則需要檢驗人員對不同的方法進行有效的方法驗證。此研究是針對飼料及飼料添加劑中沙門氏菌的檢驗方法進行驗證。

1 實驗器材與方法

1.1 主要儀器與設備

MP1100B電子天平,上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DHP-9052 36℃培養(yǎng)箱、DHP-9052B 42℃培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;BSC-1304IIA2生物安全柜,蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZH-100L高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;BILON-08無菌均質器,上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及鑒定試劑盒

沙門氏菌標準菌株:ATCC14028鼠傷寒沙門氏菌、DHL膽硫乳瓊脂,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;RV氯化鎂孔雀綠肉湯、SC亞硫酸鹽胱氨酸增菌液、NA營養(yǎng)瓊脂,青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;BPW緩沖蛋白胨水、BS亞硫酸鉍瓊脂、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒,北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 實驗培養(yǎng)基配制

1.3.1分析實驗用水檢測

配制培養(yǎng)基所用分析實驗用水,根據國標GB4789.2-2022對菌落總數進行檢測,其菌落總數為100 CFU/mL,結果<1 000 CFU/mL,符合GB 4789.28-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質量要求》[4]。

1.3.2培養(yǎng)基配制

此次實驗所用培養(yǎng)基均為成品培養(yǎng)基,根據培養(yǎng)基瓶身配制方法,準確稱量配制。所有培養(yǎng)基現配現用,并與常規(guī)實驗試劑分開存放。

1.4 樣品基質及方法選擇

實驗選擇2種不同基質的飼料及飼料添加劑樣品,分別用樣品A(飼料樣品)和樣品B(飼料添加劑樣品)表示。比對實驗樣品為25 kg預包裝魚粉,市售。實驗方法根據GB/T 13091-2018《飼料中沙門氏菌的測定》進行[5]。實驗由2人同時進行。

2 檢驗方法

2.1 加標及前增菌

由標準菌株管理員對原始凍干粉狀菌株進行復蘇傳代,選用2代菌株。臨近驗證前將菌株接出,冷藏保存,待用。全程實驗在二級生物實驗室生物安全柜中操作。實驗室溫濕度為20.0℃,50%RH。

分別無菌準確稱取25 g樣品A(飼料樣品)和樣品B(飼料添加劑樣品)至均質袋中,加入225 mL BPW緩沖蛋白胨水,接菌加標,均質器充分均質3 min后放入培養(yǎng)箱以36℃±1℃培養(yǎng)18 h。

2.2 選擇性增菌

樣品培養(yǎng)8～18 h后從培養(yǎng)箱拿出,用移液槍無菌分別吸取1 mL BPW培養(yǎng)液至10 mL RV氯化鎂孔雀綠肉湯、SC亞硫酸鹽胱氨酸增菌液中。以42℃和36℃培養(yǎng)24 h。

2.3 平板分離

培養(yǎng)后的選擇性增菌液RV氯化鎂孔雀綠肉湯和SC亞硫酸鹽胱氨酸增菌液均需要用接種環(huán)在BS亞硫酸鉍瓊脂平板和DHL膽硫乳瓊脂平板上劃線分離。平板分離的目的在于分離出單個菌落。劃線完成后,BS亞硫酸鉍瓊脂平板36℃培養(yǎng)48 h,DHL膽硫乳瓊脂平板培養(yǎng)24 h。

2.4 典型菌落純化

經過分離培養(yǎng)后,沙門氏菌在DHL膽硫乳瓊脂平板上呈黑色,在BS亞硫酸鉍瓊脂平板上也是黑色,有金屬光澤。將典型菌落在NA營養(yǎng)瓊脂上進行純化,再次分離出單菌落。

2.5 血清鑒定及生化檢驗

挑取純化后的典型菌落用國產O多價血清和H多價血清在載玻片上進行血清診斷。生化實驗原則上可以選擇全自動生化鑒定系統進行檢測,但從成本控制及多方面考慮,本次實驗選用成品沙門氏菌生化試劑盒,挑取經過純化后的菌落至9 mL 0.85%無菌生理鹽水中,制成0.5個麥氏濁度的均勻菌懸液,并根據說明書進行規(guī)范操作,最后蓋上盒蓋與三糖鐵斜面統一放入36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.6 比對實驗

此次實驗由2人進行,并形成結果比對。加做動物性飼料原料的測定比對實驗。選用出廠檢驗合格的售賣魚粉(主要成分:鳀魚)25 kg/袋,無菌采樣25 g×2份,魚粉樣品一份為正常檢測,另一份加標后檢測,樣品以盲樣形式分發(fā)給2位實驗員檢測,并做好標記,2位實驗員在檢測前均不知曉加標情況。

3 驗證結果分析與討論

3.1 驗證結果

經檢驗,2個樣品沙門氏菌典型菌落在O多價血清和H多價血清的反應下,呈凝集狀態(tài)。沙門氏菌生化成品試劑盒檢測結果見表1。

表1 沙門氏菌生化檢驗結果

通過表1可見,此次實驗生化檢驗完全符合GB/T 13091-2018《飼料中沙門氏菌的測定》6.4.2表4中A1典型的沙門氏菌反應,并結合血清診斷,可以確定樣品A(飼料樣品)和樣品B(飼料添加劑樣品)在加標后均檢出沙門氏菌。

3.2 討論

3.2.1選擇性平板的選擇

本次實驗選用的是BS亞硫酸鉍瓊脂平板和DHL膽硫乳瓊脂平板,是實驗室用成品培養(yǎng)基粉劑配制的平板,并且生長后的菌落用營養(yǎng)瓊脂進行了純化。在日常檢測過程中,如果樣品量較大,推薦使用成品平板。在沙門氏菌檢測時,其實也可以使用沙門氏菌顯色平板[6],經過分離的菌落在平板上呈現粉紅色,較容易分辨,一般來說至少選擇2種選擇性平板進行分離。

3.2.2成品三糖鐵和配制三糖鐵的比較

生化鑒定套裝中帶有成品三糖鐵斜面。說明書中也明確提示在三糖鐵穿刺時不可將接種針穿到底部。但是在實驗過程中,即使接種針沒有穿到培養(yǎng)基底部,也可能會出現硫化氫顏色過深蔓延全部等影響觀察的現象。其原因是成品三糖鐵瓶身較小,斜面長度不如配制的三糖鐵,且密封玻璃瓶身打開也不是特別方便。相比之下,把圖1(實驗室購買成品粉劑配制的三糖鐵)和圖2(生化試劑盒自帶的成品三糖鐵)生長結果進行比較,可以看出實驗室自行配制的三糖鐵斜面生長效果好于成品三糖鐵斜面。所以在三糖鐵斜面的選擇上建議實驗室選擇購買成品粉劑進行自行配制三糖鐵斜面,臨近實驗前配制,這樣效果較好。

圖1 實驗室購買成品粉劑配制的三糖鐵

圖2 生化試劑盒自帶的成品三糖鐵

3.2.3血清凝集干擾

滴O多價血清和H多價血清于載玻片上,挑取選擇性平板上典型菌落或分離純化的單菌落,觀察血清凝集情況,血清結果為凝集的。但是本次實驗所用的沙門氏菌標準菌株——鼠傷寒沙門氏菌是有Vi抗原存在的,會影響O血清凝集,凝集不太明顯。可挑取菌體至0.5～1.0 mL生理鹽水中制成菌懸液,用酒精燈煮沸后再觀察。

3.2.4人員比對結果差異

樣品A(飼料樣品)和樣品B(飼料添加劑樣品)在加標后由2名不同試驗人員進行檢測,結果均檢出沙門氏菌,并有陰性對照。盡管生化反應以及血清診斷符合典型沙門氏菌生化現象。但是在檢測過程中還是會出現略微差異。在平板分離時,檢驗人員在RV氯化鎂孔雀綠肉湯和SC亞硫酸鹽胱氨酸增菌液用接種環(huán)挑菌時,如果菌量過大,會出現分不出單菌落的情況,從而影響分離效果。本次試驗檢驗人員在平板劃線時均多劃線幾塊平板,在第二區(qū)劃線時對接種環(huán)進行加熱灼燒,冷卻后再進行下一區(qū)域劃線,確保能有單菌落分離出來再進行純化[7]。生化試劑盒的檢測中,賴氨酸脫羥酶、氰化鉀、靛基質、尿素等試驗項目2名檢測人員檢測結果完全相一致。三糖鐵斜面顏色略微差異,有個別出現黑色蔓延情況,用成品粉劑配制三糖鐵斜面后,斜面與其他生化顏色相一致。雖然有較小差異,但此次人員比對結果仍合理有效。

動物性飼料原料的測定比對實驗,對魚粉樣品及加標后樣品進行檢測,樣品為市場正常售賣的樣品。2位實驗人員有1人未檢出沙門氏菌,另一人檢出沙門氏菌,符合原標記的陰性和陽性加標后的檢測結果。未檢出沙門氏菌的實驗人員在用BS亞硫酸鉍瓊脂平板和DHL膽硫乳瓊脂平板進行培養(yǎng)后,沒有生長出典型菌落,BS亞硫酸鉍瓊脂平板無菌落生長,DHL膽硫乳瓊脂平板生長出少量雜菌。對其做血清學實驗及生化反應,不符合陽性生化特征,而加標后的魚粉樣品在平板上生長的特征及生化反應完全符合陽性結果,2人實驗結果具有較大差異,該方法適用于日常的常規(guī)樣品檢測。

4 結論

本次試驗對飼料及飼料添加劑中沙門氏菌的檢驗方法進行了方法驗證研究。對2種不同基質的樣品進行標準菌株加標檢測,同時由2個實驗人員完成,并進行人員比對。加標后的樣品均檢出沙門氏菌,動物性飼料原料的測定比對實驗證實了該方法對飼料及飼料添加劑沙門氏菌的檢測具有一定的適用性和可行性。目前沙門氏菌的檢測方法有很多,不同基質的樣品需要選擇適用的檢驗方法。無論是傳統方法還是目前較為先進、快捷的全自動生化鑒定系統檢測,在運用到正式檢測工作之前為保證方法的適用性都是需要進行方法驗證實驗。在檢測方法的選擇和方法驗證時,我們可以根據自身實驗室檢測能力,綜合考慮檢測成本去選擇實驗方法、實驗設備及試劑,在符合國標的前提下也可以對方法進行合理的優(yōu)化,從而提升今后的檢測質量。