聚乳酸/羥基乙酸磁性微球的制備及其姜黃素負載

李桂芳, 康玲玲, 朱華泰, 趙靜養(yǎng), 雷建都, 宋先亮

(北京林業(yè)大學 林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程研究中心,北京 100083)

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取出來的天然活性成分,具有抗腫瘤、抗菌、消炎、抗病毒、促進傷口愈合等多種藥用功效[1-3]。但是,姜黃素有水溶性和穩(wěn)定性差的缺點,為達到治療效果需多次給藥,臨床應用受限[4]。將姜黃素包裹在微球[5]、納米粒[6]、脂質(zhì)體[7]中,可以提高其穩(wěn)定性,增強生物利用度。磁性微球作為一種靶向給藥技術引起了人們的關注,通過施加外磁場,藥物緩釋磁性微球集中于靶器官,可緩慢釋藥,降低毒副作用[8]。金鑫等[9]采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備了地塞米松聚乳酸/羥基乙酸(PLGA)磁性微球并對其形貌及體外釋放性能進行表征,結果顯示:該微球緩釋時間長、磁響應較好、生物相容性良好,但是,該方法制備的微球粒徑不均一。諶亮等[10]采用三相微流控技術制備了PLGA微球,其粒徑分布較窄,球形圓整度極好,計算得到的離散系數(shù)(CV)為3.83%,分散性良好。任平偉等[11]采用膜乳化法和微流控法2種乳化技術制備出單分散水包油(W/O)乳液,乳液粒徑的CV分別為10.60%和3.90%,均表現(xiàn)出良好的單分散性。但是,文獻報道的工藝均需要特定的設備,制備過程復雜,難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。本研究采用攪拌-均質(zhì)兩步乳化法制備姜黃素/PLGA磁性微球,即先在低速攪拌分散后、再用高速均質(zhì)乳化,而后將溶劑揮發(fā)制得磁性微球。通過改變制備條件來優(yōu)化微球形態(tài)、粒徑分布及其載藥量、包封率,得到姜黃素/PLGA磁性微球的較優(yōu)工藝。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

聚乳酸/羥基乙酸(PLGA)共聚物,重均相對分子質(zhì)量(Mw)約44 000,濟南岱罡生物工程有限公司;姜黃素(質(zhì)量分數(shù)98%),百靈威科技有限公司;油酸(OA,質(zhì)量分數(shù)90%),西格瑪試劑;FeCl3·6H2O(質(zhì)量分數(shù)99%)、FeCl2·4H2O(質(zhì)量分數(shù)98%),上海麥克林生化科技有限公司;聚乙烯醇(PVA),Mw約27 000,羅恩試劑;磷酸鹽緩沖溶液(PBS),0.01 mol/L,北京雷根生物技術有限公司。NH3·H2O、HClO4、二氯甲烷(DCM)、無水乙醇、無水甲醇,均為分析純;所用水均為去離子水。

LW300-28CT光學顯微鏡;FSH-2A高速均質(zhì)機,金壇區(qū)西城新瑞儀器廠;UV759CRT型紫外分光光度計,上海佑科有限公司;Mastersizer3000馬爾文激光粒度儀,馬爾文儀器公司;7404型振動樣品磁強計,美國LakeShore公司;Riga Ku TG-DTA8122熱重分析儀,日本理學公司。

1.2 姜黃素/PLGA磁性微球的制備

1.2.1Fe3O4@OA的合成 參考文獻[12]的方法,將1.07 g(5.3 mmol)的FeCl2·4H2O和2.86 g(10.6 mmol)的FeCl3·6H2O按物質(zhì)的量比1∶2加入30 mL水中,攪拌溶解,通氮除氧30 min,升溫至60 ℃。在快速攪拌下加入NH3·H2O調(diào)pH值至9,當體系變?yōu)楹谏?滴加1.4 mL的油酸,恒溫保持10 min,隨后升溫至90 ℃,繼續(xù)攪拌反應30 min。然后降至室溫,加入2 mol/L的HClO4調(diào)pH值至4,將黑色沉淀通過磁場分離進行洗滌,制備得到油酸改性Fe3O4(Fe3O4@OA)磁性納米顆粒(粒徑8 nm),保存在乙醇中備用。

1.2.2PLGA磁性微球負載姜黃素 稱取適量PVA溶于PBS溶液(pH值為7.4)中,充分溶解后得到一定質(zhì)量分數(shù)的PVA溶液,后續(xù)作為水相使用。稱取一定量的PLGA、Fe3O4@OA、姜黃素溶于1 mL二氯甲烷/甲醇(體積比9∶1)混合溶劑中,作為油相。在160 r/min攪拌下將油相滴加到PVA溶液中,攪拌3 min,得到初乳液,而后迅速取出,再高速均質(zhì)3 min,得到終乳液。將終乳液在600 r/min下攪拌2 h,揮發(fā)有機溶劑,得到固化微球。最后3 000 r/min離心,用去離子水洗滌,冷凍干燥得到姜黃素/PLGA磁性微球。在合成過程中不添加Fe3O4@OA納米顆粒和姜黃素得到攪拌-均質(zhì)PLGA空白微球,僅添加Fe3O4@OA制備PLGA磁性微球。

1.2.3直接均質(zhì)法制備PLGA空白微球 稱取一定量的PLGA溶于1 mL二氯甲烷/甲醇(體積比9∶1)混合溶劑中,作為油相。將油相直接滴入到一定體積的PVA溶液(水相)中,置于均質(zhì)機高速均質(zhì)分散,得到終乳液。將終乳液600 r/min攪拌2 h,揮發(fā)有機溶劑,得到固化微球。最后3 000 r/min離心,用去離子水洗滌,冷凍干燥得到均質(zhì)PLGA空白微球。

1.3 微球載藥性能

1.3.1姜黃素標準曲線的建立 精密稱取姜黃素標準品10 mg,與10 mL甲醇配制成1.00 g/L的姜黃素甲醇溶液,然后分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.05、 0.10、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、 1.00、 3.00 mg/L的系列標準溶液。利用紫外分光光度計測定不同質(zhì)量濃度的姜黃素標準溶液在特定吸收波長處的吸光度(A),做3次實驗,取平均值。通過全波長掃描法確定姜黃素的最大吸收波長在432 nm處,并對其標準溶液進行吸光度測定,得到質(zhì)量濃度(C)與吸光度(A)的回歸方程A=0.295 8C+0.008 5,R2=0.999 7(線性范圍:0.05～3.00 mg/L)。

1.3.2微球載藥率與包封率 精密稱量姜黃素/PLGA磁性微球10 mg,加入二氯甲烷/無水甲醇(體積比為1∶24)混合溶液破乳溶解,外加磁場作用下靜置沉淀,在波長432 nm處測定上清液的吸光度,根據(jù)標準曲線計算藥物質(zhì)量,根據(jù)式(1)、(2)計算包封率(EE)、載藥率(DL):

EE=m1/m2×100%

(1)

DL=m1/m3×100%

(2)

式中:m1—包封的姜黃素質(zhì)量,mg;m2—微球中姜黃素的總質(zhì)量,mg;m3—姜黃素微球的總質(zhì)量,mg。

1.3.3微球的體外釋放 精確稱量凍干后的載藥磁性微球20 mg,溶于5 mL不同pH值的PBS緩沖液中,而后移入截留分子質(zhì)量(MWCO)為3 500 u的透析袋中,浸泡在45 mL相應pH值的PBS緩沖液中,在搖床中恒溫(37 ℃,150 r/min)振蕩。定時取出上清液1 mL,并補充PBS緩沖液1 mL,在432 nm波長處測定上清液吸光度,按式(3)計算藥物累積釋放率(Q)。

Q=(Cn+Cn-1+Cn-2+…+C1)V/(m×DL)×100%

(3)

式中:Cn—各時間點測得的藥物質(zhì)量濃度,mg/L;V—釋放介質(zhì)的體積,mL;m—微球的質(zhì)量,mg。

1.4 分析表征

1.4.1形貌分析 取1滴姜黃素/PLGA磁性微球溶液滴于載玻片上,通過光學顯微鏡觀察其形貌,并通過Image J軟件測量微球的粒徑大小。

1.4.2磁感應強度 稱取一定量的Fe3O4@OA和姜黃素/PLGA磁性微球,利用振動樣品磁強計(VSM)對Fe3O4@OA和姜黃素/PLGA磁性微球進行磁性能分析。

1.4.3熱重分析 控制熱重分析條件為:氮氣氣氛,25～650 ℃,升溫速度為10 ℃/min。熱重分析檢測后剩余的質(zhì)量為微球中所含的Fe3O4的質(zhì)量,按式(4)計算Fe3O4在Fe3O4@OA中的質(zhì)量分數(shù),從而得到Fe3O4@OA與姜黃素/PLGA磁性微球的質(zhì)量比值,即可視為微球的含磁量。

ω=(1-m失/m總)×100%

(4)

式中:ω—Fe3O4占Fe3O4@OA的質(zhì)量分數(shù),%;m失—Fe3O4@OA納米顆粒分解的質(zhì)量,mg;m總—Fe3O4@OA納米顆粒的質(zhì)量,mg。

2 結果與討論

2.1 姜黃素/PLGA磁性微球制備工藝探討

2.1.1乳化方法的影響 乳化方法是影響微球均一性的重要因素,選擇合適的乳化方法可以制備粒徑均一的微球。采用直接均質(zhì)法和攪拌-均質(zhì)兩步乳化法制備PLGA空白微球,通過二者的顯微鏡圖對比,如圖1所示,可以發(fā)現(xiàn)采用攪拌-均質(zhì)兩步乳化法制備的微球比較均一,平均粒徑為(2.10±0.34)μm。這主要是因為第一步低速攪拌時獲得了乳滴粒徑較大且不均一的初乳液,然后再將初乳液高速均質(zhì)時,大的乳滴更容易破碎變小,經(jīng)溶劑揮發(fā)后便獲得了粒徑較均一的乳滴和微球。因此,后續(xù)實驗采用攪拌-均質(zhì)兩步乳化法制球。

a.攪拌-均質(zhì)stirring-homogenization; b.直接均質(zhì)direct homogenization圖1 不同乳化方法制備的PLGA空白微球的光學顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Optical microscopic photos of PLGA blank microspheres with different emulsification methods

2.1.2高速均質(zhì)速度的影響 均質(zhì)速度是影響微球粒徑大小的直接因素,分別控制高速均質(zhì)速度為9 000、 12 000、 15 000和18 000 r/min,研究其對微球粒徑及分布的影響,結果見圖2(a)。由圖可知,隨著均質(zhì)速度的增加,微球的粒徑逐漸減小。當高速均質(zhì)速度為15 000和18 000 r/min時,微球均表現(xiàn)出較小的粒徑和較好的均一性,粒徑分別為(2.10±0.35)μm和(1.90±0.31)μm,出于安全及能耗的考慮,故選擇15 000 r/min進行后續(xù)的實驗。

a.高速均質(zhì)速度 high speed homogenization speed; b.水油相體積比 volume ratio of water to oil phase; c.PLGA用量PLGA dosage;

2.1.3水油相體積比的影響 水油比是乳液穩(wěn)定性和分散性的決定因素,水的比例越大,液滴之間的間距越大,不易發(fā)生吞并現(xiàn)象,且整個乳液體系的黏度降低,乳滴更容易被打散,從而獲得粒徑更小的乳滴。分別控制水油體積比為5∶1、 10∶1、 15∶1和20∶1,油相體積為1 mL,研究其對微球粒徑大小及均一性的影響,結果見圖2(b)。從圖2(b)可以看出,水油比值為5時,微球粒徑相對較大,隨著水油比的增加,粒徑較小的微球越來越多,當水油比值為10時,粒徑(2.20±0.35)μm,粒徑分布相對均一,故采用水油比10∶1進行后續(xù)實驗。

2.1.4PLGA用量的影響 PLGA的用量決定了油相的黏度,油相黏度增加,對流減小,可以制備更加均一的微球?？疾炝?0、 80、 100和120 mg的PLGA用量對微球粒徑及均一性的影響,結果見圖2(c)。隨PLGA用量的增加,微球粒徑增大。當PLGA用量為100 mg時,粒徑(2.10±0.32)μm,微球的粒徑分布較為均一,故選擇100 mg PLGA用量進行后續(xù)實驗。

2.1.5水相PVA質(zhì)量分數(shù)的影響 PVA作為一種表面活性劑,可以使油水相界面更加穩(wěn)定,從而影響微球的粒徑[13]?？疾炝?.5%、 1.0%、 2.0%和3.0%的水相PVA質(zhì)量分數(shù)對微球粒徑大小及分布的影響,結果見圖2(d)。隨水相質(zhì)量分數(shù)的增加,微球粒徑反而減小,當PVA的質(zhì)量分數(shù)為1.0%時,粒徑(1.70±0.29)μm,微球的粒徑相對均一,故選擇1.0%的水相質(zhì)量分數(shù)進行后續(xù)實驗。

2.1.6Fe3O4@OA用量的影響 Fe3O4@OA納米顆粒作為一種磁性功能材料,可以賦予微球靶向性?？疾炝?0、 30、 40和50 mg的Fe3O4@OA用量對微球的粒徑及均一性的影響,結果見圖2(e)。隨著Fe3O4@OA用量的增多,微球的粒徑逐漸增大,這主要是因為微球中的磁性納米顆粒存在相互作用。當Fe3O4@OA的用量為40 mg時微球粒徑分布較為均一,粒徑為(3.40±0.40)μm,故選擇40 mg的Fe3O4@OA加入量進行后續(xù)實驗。

2.1.7姜黃素用量的影響 姜黃素的用量直接影響了載藥磁性微球的載藥量和包封率,考察了5.1、 8.1、 10.0和13.0 mg的姜黃素用量對載藥磁性微球的影響。姜黃素的加入對微球的粒徑影響不大,平均粒徑均約為3.00 μm,如圖2(f)所示。但隨著姜黃素的加入量增加,微球的載藥量逐漸增加,包封率先增加后降低,如圖3所示。這主要是因為載體材料PLGA對藥物的包封能力有限,當超過限度,包封率會出現(xiàn)下降的趨勢。當姜黃素加入量為10.0 mg時包封率最高,故選擇較優(yōu)條件為10.0 mg的姜黃素加入量。

圖3 姜黃素用量對微球載藥性能的影響Fig.3 Effect of curcumin dosage on drug loading performance

綜上,制備微球的最優(yōu)工藝條件為:選用攪拌-均質(zhì)兩步乳化法,高速均質(zhì)轉(zhuǎn)速為15 000 r/min,水油相體積比為10∶1,PLGA用量為100 mg,PVA的質(zhì)量分數(shù)為1%,Fe3O4@OA的用量為40 mg,姜黃素的用量為10 mg,此條件下制得的微球包封率為97.09%,載藥率為6.40%。

2.2 姜黃素/PLGA磁性微球的理化性能

2.2.1形貌分析 按照上述最優(yōu)條件制備姜黃素/PLGA磁性微球,顯微鏡下觀察到該微球表面光滑,粒徑分布較為均一,如圖4(a)和(b)所示。采用Image J軟件測量微球粒徑為(3.50±0.56)μm,通過激光粒度儀測得平均粒徑為3.60 μm,粒徑分布較窄,多分散性指數(shù)(PDI)為0.38。

圖4 姜黃素/PLGA磁性微球的光學顯微鏡照片(a)、粒徑分布(b)及磁滯曲線(c)

2.2.2磁感應強度 圖4(c)為Fe3O4@OA和姜黃素/PLGA磁性微球在298.15 K下的磁滯曲線。由圖可知,與Fe3O4@OA的飽和磁化強度(68.69 A·m2/kg)相比,姜黃素/PLGA磁性微球(14.12 A·m2/kg)明顯下降。主要原因是聚合物對Fe3O4@OA的包覆,PLGA包覆層減弱了Fe3O4@OA納米顆粒之間的相互作用,從而降低了聚合物磁性微球的飽和磁化強度,但是從圖5可以看出目前的磁化強度仍然可以實現(xiàn)對微球的磁控。

a.0 min; b.1 min; c.3 min圖5 姜黃素/PLGA磁性微球的磁吸附效果Fig.5 Magnetic adsorption effect of curcumin/PLGA magnetic microspheres

2.2.3熱重分析 根據(jù)文獻[14]報道,通過熱重分析可以測定磁性微球中Fe3O4@OA的質(zhì)量分數(shù)?？刂茻嶂胤治鰲l件為氮氣氣氛,25～650 ℃,升溫速率為10 ℃/min。圖6為Fe3O4@OA、姜黃素/PLGA微球和姜黃素/PLGA磁性微球的TG曲線。由圖可知,隨著溫度的上升,樣品逐漸失重。姜黃素/PLGA微球從250 ℃開始失重,當溫度達到350 ℃時幾乎完全分解。Fe3O4@OA納米顆粒從160 ℃開始失重,此階段為油酸的分解,當溫度達到400 ℃時趨于平衡,剩余的物質(zhì)為Fe3O4。通過式(4)計算得到,Fe3O4@OA納米顆粒中油酸的質(zhì)量分數(shù)約為11.88%,Fe3O4的質(zhì)量分數(shù)約為88.12%。姜黃素/PLGA磁性微球從250 ℃開始失重,約300 ℃時趨于平衡,此時體系中有機物幾乎完全分解,所剩質(zhì)量為Fe3O4的質(zhì)量,根據(jù)式(4)可以計算得到Fe3O4@OA納米顆粒的質(zhì)量(2.21 mg),Fe3O4@OA納米顆粒占姜黃素/PLGA磁性微球(7.90 mg)的質(zhì)量分數(shù)即為磁性微球含磁量,約為27.98%。

圖6 不同樣品的熱重分析

2.3 姜黃素/PLGA磁性微球的體外釋放

模擬人體正常生理環(huán)境及腫瘤外微環(huán)境的釋藥情況,釋放結果如圖7所示。

由于腫瘤細胞增殖速度很快,其無氧呼吸代謝產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì),導致其內(nèi)外環(huán)境pH值降低[15-16]。血液等正常體液環(huán)境的pH值為7.4,腫瘤細胞外微環(huán)境的pH值范圍為6.5～7.2,腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境的pH值范圍為4～6[15]。姜黃素/PLGA磁性微球作為一種注射制劑,存在環(huán)境主要是人體體液及腫瘤外微環(huán)境,因此,實驗選用最優(yōu)工藝條件制備微球在pH值7.4和6.5條件下進行藥物體外釋放。在藥物釋放的初期(1 h內(nèi)),釋藥率分別為4.53%和1.38%,未出現(xiàn)突釋現(xiàn)象,說明微球?qū)λ幬锏陌院?且微球表面吸附的藥物量較少。釋放168 h后,藥物累計釋放率分別達到了40.66%(pH值7.4)和80.75%(pH值6.5),表明姜黃素/PLGA磁性微球在酸性環(huán)境下比中性環(huán)境下釋放更快,這主要是因為在酸性條件下PLGA的酯鍵更容易斷裂,降解速率更快[16]。分析在pH值7.4條件下的釋放曲線可知,釋放408 h后,曲線平緩,說明該微球緩慢釋放藥物,有明顯的緩釋效果。

3 結 論

3.1創(chuàng)新采用攪拌-均質(zhì)兩步乳化法制備姜黃素/PLGA磁性微球,通過單因素試驗優(yōu)化得到的最優(yōu)制備條件為高速均質(zhì)轉(zhuǎn)速為15 000 r/min,水油相體積比為10∶1,PLGA用量為100 mg,PVA的質(zhì)量分數(shù)為1%,Fe3O4@OA的用量為40 mg,姜黃素的用量為10 mg。此條件下制備的姜黃素/PLGA磁性微球粒徑相對較小,約為3.60 μm,分布較為均一,PDI達到0.38,包封藥物的能力較強,包封率可以達到97.09%,且具有超順磁性(含磁量約為27.98%)?？赏ㄟ^磁控靶向腫瘤組織,實現(xiàn)藥物在病灶部位的富集。該方法只需要采用常規(guī)設備,操作簡單且易于批量制備。

3.2體外釋放結果證明姜黃素/PLGA磁性微球具有明顯的緩釋功能,釋藥168 h后,藥物累計釋放率分別達到40.66%(pH值7.4)和80.75%(pH值6.5),在藥物遞送系統(tǒng)方面具有極大的潛能。