雪松松針多糖的醇沉、脫蛋白工藝及抗氧化活性研究

馬趣環(huán), 王 信, 石曉峰, 沈 薇, 范 彬, 王新娣

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,甘肅 蘭州 730050; 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000)

藥用松針是松科植物多個品種針狀葉的統(tǒng)稱,始載于《名醫(yī)別錄》,被列為上品,《本草綱目》對其亦有記載[1],氣味苦、溫、無毒,久服令人不老,輕身益氣,主風(fēng)濕瘡,生毛發(fā),安五臟,守中,不饑延年。在東亞地區(qū),松針也被制成松針粉、松針酒、松針茶等[2],這種做法與藥王孫思邈創(chuàng)立的自然養(yǎng)生之“服松針法”相符。雪松是松科植物雪松屬(Cedrus)常綠喬木[3],其針葉藥用歷史悠久,主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、黃酮類、苯丙素類、有機(jī)酸類、三萜類、甾體類、多糖及針葉膠類等[4]。有關(guān)雪松松針多糖的研究甚少,僅見葛霞等[5]水提法提取雪松松針多糖和本課題組前期優(yōu)化雪松松針多糖提取工藝的報道[6]。多糖是生命有機(jī)體的重要組成成分,為糖苷鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的高聚物,大量存在于高等植物、動物細(xì)胞膜以及微生物細(xì)胞壁中,具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗自由基活性和抗氧化、抗衰老、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂血糖、抗輻射等作用[7-8]。為了對雪松松針多糖進(jìn)行深入探索與開發(fā),本研究對雪松松針多糖醇沉、脫蛋白工藝條件進(jìn)行了篩選,并對純化后的多糖的抗氧化活性進(jìn)行了體外評價。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

雪松松針于2016年6月采自甘肅省蘭州市濱河路,經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院何福江研究員、石長栓副研究員鑒定為雪松屬植物雪松Cedrusdeodara(Roxb.ex D.Don)G.Don的針葉。

D-(+)-無水葡萄糖對照品(批號MUST-14072601),中國科學(xué)院成都生物研究所提供;考馬斯亮藍(lán)G-250,中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站;牛血清白蛋白(BSA),生物工程(上海)股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸(ABTS),美國Sigma公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT),天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;抗壞血酸(Vc),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純,苯酚為重蒸苯酚,水為蒸餾水。

UV-1800型紫外可見分光光度計,日本島津公司;AE-260型萬分之一分析天平;CP225D型十萬分之一電子分析天平;SK3310LHC超聲清洗儀器,上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 雪松松針多糖醇沉工藝優(yōu)化

1.2.1多糖粗提液的制備 參考文獻(xiàn)[9]的方法,稱取陰干粉碎后的雪松松針(粒徑≤450 μm)80 g,置于圓底燒瓶中,首次提取按液料比13∶1(mL∶g,下同)加入蒸餾水,第2次提取按液料比10∶1加入蒸餾水,回流提取2次,每次120 min。過濾,合并濾液,濃縮至1 600 mL,得到雪松松針多糖的粗提液。

1.2.2多糖一級醇沉工藝的優(yōu)化

1.2.2.1單因素試驗 將粗提液250 mL分成5等份,分別按粗提液體積和松針干質(zhì)量的比例(濃縮比)1∶1、 2∶1、 3∶1、 4∶1和5∶1(mL∶g,下同)進(jìn)行減壓濃縮,再將每份濃縮液分成3等份,置于250 mL的三角瓶中,加入適量無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,密封,室溫靜置醇沉12 h,3 000 r/min離心15 min,棄去上清液,沉淀用15 mL的70%乙醇洗滌,離心收集沉淀,水浴揮去殘存乙醇后,于60 ℃烘干,稱量,計算粗多糖得率,分析粗提液濃縮比對雪松松針多糖得率的影響[10]。在粗提液濃縮比為3∶1,醇沉?xí)r間12 h,乙醇醇沉體積分?jǐn)?shù)分別為40%、 50%、 60%、 70%、 80%的條件下,計算粗多糖得率,分析醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖得率的影響。在粗提液濃縮比為3:1,醇沉?xí)r間12 h,乙醇醇沉體積分?jǐn)?shù)為71%,濃縮液溫度分別為20、 40、 60和80 ℃的條件下,計算粗多糖得率,分析濃縮溫度對多糖得率的影響。在粗提液濃縮比為3∶1,乙醇醇沉體積分?jǐn)?shù)為71%,濃縮液溫度分別為40 ℃,醇沉?xí)r間分別為4、 8、 12、 24和36 h的條件下,計算粗多糖得率,分析醇沉?xí)r間對多糖得率的影響。

1.2.2.2響應(yīng)面分析法 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,固定濃縮溫度為40 ℃,利用Box-Behnken中心組合對濃縮比、醇沉體積分?jǐn)?shù)及醇沉?xí)r間進(jìn)行3因素3水平的試驗設(shè)計,依據(jù)響應(yīng)面結(jié)果分析確定松針多糖最佳的一級醇沉工藝參數(shù)[10-12]。

1.2.3多糖二級醇沉體積分?jǐn)?shù)的篩選 按優(yōu)選的一級醇沉參數(shù),將雪松松針粗提液濃縮,加入無水乙醇至相應(yīng)的醇體積分?jǐn)?shù),搖勻,靜置,離心,收集上清液,再按濃縮比1∶1濃縮,濃縮液分成5等份,分別加無水乙醇至醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、 60%、 70%、 80%、 90%,其余操作同1.2.2.1節(jié),以多糖得率為指標(biāo),優(yōu)選二級醇沉體積分?jǐn)?shù)。

1.3 雪松松針多糖脫蛋白工藝優(yōu)化

1.3.1Sevage法脫蛋白 吸取二級醇沉得到的質(zhì)量濃度為0.023 g/mL的雪松松針多糖溶液20 mL,加入一定體積Sevage試劑(氯仿/正丁醇體積比4∶1),振蕩30 min,在6 000 r /min 下離心15 min,棄去下層有機(jī)相和中間蛋白質(zhì)層,按此法脫蛋白3次,收集上清液,測定上清液中多糖和蛋白質(zhì)的含量,計算多糖損失率和蛋白質(zhì)清除率[13-14],以此考察合適的Sevage試劑用量,實驗中多糖溶液與Sevage試劑的體積比分別為0.5∶1、 1∶1、 2∶1和3∶1。確定最佳Sevage法脫蛋白的條件后,以50 mL質(zhì)量濃度0.023 g/mL雪松松針多糖溶液進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2三氯乙酸(TCA)法脫蛋白 吸取二級醇沉得到的質(zhì)量濃度為0.023 g /mL的雪松松針多糖溶液20 mL,加入160 g/L TCA 20 mL,振蕩30 min,4 ℃條件下放置12 h后,6 000 r /min 離心10 min,收集上清液。上清液用NaOH 調(diào)至中性后,測定上清液中多糖和蛋白質(zhì)的含量,并計算多糖損失率和蛋白質(zhì)清除率。

1.3.3脫蛋白次數(shù)的考察 吸取二級醇沉得到的質(zhì)量濃度為0.023 g /mL的雪松松針多糖溶液20 mL,5份,按照1∶1的體積比加入Sevage試劑,分別給予1、 2、 3、 4、 5次脫蛋白,計算蛋白質(zhì)清除率。

1.4 驗證試驗及計算

1.4.1多糖含量及損失率測定 稱取雪松松針3份,每份300 g,按優(yōu)選得到的一級、二級醇沉參數(shù)和脫蛋白工藝條件操作,冷凍干燥得純化后的精制雪松松針多糖,采用苯酚-硫酸法[11]測定其多糖含量。

以葡萄糖質(zhì)量濃度(C,g/L)為橫坐標(biāo),以吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程A=27.114C+0.042 3(R2=0.999 3)。精密吸取供試品溶液適量,置于具塞試管中,用蒸餾水補(bǔ)體積至2.00 mL,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液1 mL,于冰水浴中加入5 mL硫酸,振蕩,搖勻,于40 ℃水浴30 min,取出,放入冰水浴中終止反應(yīng)。于488 nm測定A,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中多糖的質(zhì)量,按式(1)計算多糖損失率。

x=(m1-m2)/m1×100%

(1)

式中:x—多糖損失率,%;m1—處理前多糖質(zhì)量,mg;m2—處理后多糖質(zhì)量,mg。

1.4.2蛋白質(zhì)的含量及清除率測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[15],精密稱取BSA 25.5 mg,加水溶解并定容于25 mL容量瓶中,然后精密吸取BSA溶液0、 0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25 mL,分別置于具塞試管中,用蒸餾水補(bǔ)充體積至1.50 mL,配制成系列質(zhì)量濃度的BSA對照品溶液。然后加入考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL后,搖勻,靜置5 min,于595 nm測定A。以C為橫坐標(biāo),以A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:A=5.924C+0.097(R2=0.999 0)。于595 nm測定A,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,按式(2)計算蛋白清除率。

y=(m3-m4)/m3×100%

(2)

式中:y—蛋白質(zhì)清除率,%;m3—處理前蛋白質(zhì)質(zhì)量,mg;m4—處理后蛋白質(zhì)質(zhì)量,mg。

1.5 雪松松針多糖抗氧化性能的評價

1.5.1溶液的配制 精密稱取純化后雪松松針一級、二級醇沉多糖各40.00 mg,用水溶解并定容至10 mL容量瓶中,即得供試品溶液。

精密稱取Vc 20 mg,用水溶解并定容至5 mL容量瓶中,即得Vc對照品溶液。精密稱取BHT 10 mg,用無水乙醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,即得BHT對照品溶液。精密稱取DPPH試劑8 mg,用無水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,即得DPPH自由基(DPPH·)溶液。精密稱取ABTS試劑0.192 2 g,用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中作為A液;精密稱取過硫酸鉀0.067 6 g,用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中作為B液;然后按2∶1的體積比將A液、B液混勻,避光12 h,備用。臨用前用無水乙醇稀釋至吸光度為0.6±0.1,即得ABTS自由基(ABTS·)工作液。

1.5.2清除DPPH·活性 將供試品溶液及對照品Vc、BHT溶液稀釋成系列濃度0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 2.4、 2.8 g/L的溶液,然后分別精密移取這一系列質(zhì)量濃度的供試品溶液及Vc、BHT對照品溶液各1 mL于10 mL的比色管中,各加DPPH·溶液2 mL,再加50%乙醇2 mL,搖勻,室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測定吸光值(A1),同時以無水乙醇為參比測定DPPH·空白溶液吸光度值(A0),平行實驗3次,按式(3)計算清除率[16]。

C=(A0-A1)/A0×100%

(3)

式中:C—自由基清除率,%;A0—參比吸光值;A1—樣品吸光值。

1.5.3清除ABTS·活性 將供試品溶液及對照品Vc、BHT溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度40、 80、 120、 160、 200 mg/L的溶液,然后分別精密移取這些供試品溶液及Vc、BHT對照品溶液各1 mL于10 mL的比色管中,各加ABTS·工作液3 mL,搖勻,放置10 min后,在734 nm處測定A1,同時以40%乙醇為參比測定ABTS·工作液空白溶液的A0,平行實驗3次,按式(3)計算清除率[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 雪松松針多糖醇沉工藝條件的優(yōu)化

2.1.1單因素試驗結(jié)果 雪松松針多糖一級醇沉的單因素結(jié)果見圖1。

a.濃縮比concentration ratio; b.乙醇體積分?jǐn)?shù)alcohol volume fraction; c.溫度temperature; d.醇沉?xí)r間alcohol precipitation time

由圖1(a)可知,濃縮比為1∶1～3∶1時,樣品中的多糖得率逐漸增大,濃縮比值為3時多糖得率最大,之后略有下降,為此選擇3∶1作為最佳濃縮比。由圖1(b)可知,多糖得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時其多糖得率最大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時多糖得率略有降低,因此選擇70%為最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)。由圖1(c)可知,濃縮液溫度較低時多糖的得率較高,20 ℃與40 ℃沒有顯著差異,因此選擇40 ℃為適宜的溫度。由圖1(d)可知,多糖得率隨醇沉?xí)r間延長而增多,8 h后基本沒有大的變化,故選擇8 h為最佳醇沉?xí)r間。

2.1.2響應(yīng)面分析法試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果得出雪松松針多糖一級醇沉最佳條件為:粗多糖提取液濃縮比為3∶1,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%,醇沉溫度為40 ℃,醇沉?xí)r間為8 h。由于醇沉溫度對多糖得率影響較小,故而在此基礎(chǔ)上,固定醇沉溫度為40 ℃,以濃縮比(A)、醇沉體積分?jǐn)?shù)(B)、醇沉?xí)r間(C)為自變量,松針多糖得率(Y)為響應(yīng)值,利用Box-Behnken中心組合進(jìn)行3因素3水平的試驗設(shè)計來確定松針多糖最佳的一級醇沉參數(shù),響應(yīng)面分析結(jié)果見表1及表2。

表1 Box-Behnken 試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表2 回歸統(tǒng)計分析結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表1實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到二元多項回歸模型為Y=3.83+0.13A+0.051B+0.035C-0.015AB-0.018AC-0.033BC-0.32A2-0.18B2-0.036C2,相關(guān)系數(shù)R2=0.975 3,說明回歸方程擬合情況良好,結(jié)果可靠[17]。由表2可知,總回歸方程模型的P<0.000 1,表明該模型的擬合度顯著,失擬值P=0.271 8>0.05,表明此項沒有顯著性意義,說明數(shù)據(jù)沒有異常點(diǎn),可用此模型預(yù)測雪松松針多糖的醇沉參數(shù)。由表中一次項及二次項的P值可以看出,A、B、C、A2、B2對松針多糖的醇沉得率有顯著性影響(P<0.05),交互項及C2項均無統(tǒng)計學(xué)意義。由響應(yīng)面結(jié)果可以看出,各因素水平對松針多糖得率的影響大小順序為:濃縮比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>醇沉?xí)r間。由表2和表3的分析結(jié)果證實試驗?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確可靠,可用于松針多糖的一級醇沉工藝的預(yù)測。

利用Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,得出松針多糖最佳一級醇沉條件為:濃縮比3.18∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.00%、醇沉?xí)r間9.85 h,在此條件下多糖的理論得率為3.85%。考慮到實驗條件的可操作性,將工藝參數(shù)調(diào)整為:濃縮比3∶1、醇沉體積分?jǐn)?shù)71.00%、醇沉?xí)r間10 h。依據(jù)調(diào)整后的醇沉條件進(jìn)行驗證試驗,平行試驗3次,計算得多糖的平均得率為3.81%,與預(yù)測值相比較低,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%,表明采用此工藝條件準(zhǔn)確可靠,可作為松針多糖的一級醇沉工藝。

2.1.3二級醇沉體積分?jǐn)?shù)的篩選結(jié)果 雪松松針多糖二級醇沉體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選結(jié)果見圖2。由圖可知,二級醇沉多糖的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高而增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時多糖得率為4.49%,與乙醇體積分?jǐn)?shù)90%的4.50%相差不大,為了節(jié)約溶劑,故將二級醇沉的乙醇體積分?jǐn)?shù)定為80%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對二級醇沉多糖得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the polysaccharide yield of secondary alcohol precipitation

2.2 雪松松針多糖脫蛋白的工藝條件

2.2.1Sevage法和TCA法脫蛋白比較 Sevage法和TCA法脫除雪松松針多糖中的蛋白質(zhì)結(jié)果表明:Sevage法蛋白質(zhì)清除率為86.22%,多糖損失率為10.22%;TCA法蛋白質(zhì)清除率為84.49%,多糖損失率為22.73%。說明二者蛋白質(zhì)清除率相當(dāng),但Sevage法的多糖損失率較低,故選擇Sevage法脫除松針多糖中的蛋白質(zhì)。

2.2.2Sevage試劑用量的考察結(jié)果 由圖3可見,隨著Sevage試劑用量增大,蛋白質(zhì)清除率相應(yīng)增大;當(dāng)體積比為1∶1～3∶1時,蛋白質(zhì)清除率幾乎相當(dāng),故選用1∶1的體積比進(jìn)行多糖脫蛋白質(zhì)。

圖3 Sevage試劑用量考察結(jié)果

2.2.3脫蛋白次數(shù)的考察結(jié)果 由圖4可見,脫除蛋白3次后,蛋白質(zhì)基本完全脫除,故將脫蛋白次數(shù)定為3次。

圖4 脫蛋白質(zhì)次數(shù)的考察結(jié)果

3份雪松松針按優(yōu)選得到的一級、二級醇沉參數(shù)和脫蛋白工藝條件操作,冷凍干燥得純化后的精制雪松松針多糖,經(jīng)UV法測得純化后一級、二級醇沉多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)以葡萄糖折算分別為35.36%、 36.62%。

2.3 雪松松針多糖抗氧化性能的評價結(jié)果

2.3.1清除DPPH·能力 研究了不同質(zhì)量濃度的雪松松針多糖、Vc及BHT清除DPPH·的能力,結(jié)果見圖5(a)。由圖可見,質(zhì)量濃度增至2.0 g/L后,清除DPPH·能力依次為Vc>二級醇沉多糖>BHT>一級醇沉多糖,此時二級醇沉多糖清除DPPH自由基能力稍強(qiáng)于BHT。

圖5 雪松松針多糖對DPPH·(a)及ABTS·(b)的清除能力

2.3.2清除ABTS·能力 不同質(zhì)量濃度的雪松松針多糖、Vc及BHT清除ABTS·的結(jié)果見圖5(b),依次為Vc>二級醇沉多糖>BHT>一級醇沉多糖,二級醇沉多糖清除ABTS·能力強(qiáng)于BHT,且當(dāng)質(zhì)量濃度為200 mg/L時,清除ABTS·能力與Vc、BHT一致,清除率達(dá)到98%以上。

3 結(jié) 論

3.1以多糖的得率為指標(biāo),在單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面Box-Behnken模型對影響雪松松針多糖醇沉的關(guān)鍵因素進(jìn)行考察,最終確定雪松松針多糖最佳一級醇沉工藝為粗提液體積和松針干質(zhì)量的比例(濃縮比)為3∶1,乙醇體積分?jǐn)?shù)71%,醇沉溫度40 ℃,醇沉?xí)r間10 h,此條件下多糖得率為3.81%。收集多糖一級醇沉后的上清液再按1∶1的比例濃縮,篩選得到二級醇沉的較優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,此條件下的多糖得率為4.50%。

3.2以蛋白質(zhì)清除率和多糖損失率為指標(biāo),比較了Sevage法和三氯醋酸(TCA)法對松針多糖的脫蛋白效果,結(jié)果表明:Sevage法脫蛋白效率優(yōu)于TCA法,其最佳條件為Sevage試劑與多糖溶液的體積比為1∶1,脫除蛋白次數(shù)為3次。

3.3試驗確定的雪松松針多糖的醇沉、脫蛋白工藝條件,經(jīng)3批試驗驗證合理可行;UV法測脫蛋白后的一級、二級醇沉多糖平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)以葡萄糖折算分別為35.36%、 36.62%。

3.4雪松松針多糖具有DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力,其中純化后的雪松松針80%醇沉多糖表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。