塔拉粉酶解廢液HPLC指紋圖譜及2個(gè)主成分含量測(cè)定方法研究

管勤昊, 湯麗華, 張亮亮, 徐 曼, 劉義穩(wěn), 黃立新*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國(guó)家工程研究中心,江蘇 南京 210042;2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 3.華僑大學(xué) 先進(jìn)碳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究院,福建 廈門(mén) 361021; 4.五峰赤誠(chéng)生物科技股份有限公司,湖北 宜昌 443000)

塔拉是一種分布于南美洲西北部的豆科植物,是提取植物單寧的重要原料。近年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)五倍子價(jià)格飆升,很多廠家已轉(zhuǎn)向進(jìn)口塔拉粉生產(chǎn)塔拉單寧以取代五倍子單寧,或用來(lái)制備工業(yè)沒(méi)食子酸及其衍生物[1]。塔拉單寧是塔拉粉中的主要成分,屬于水解類(lèi)沒(méi)食子單寧,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為多沒(méi)食子酸?；鼘幩?在酸、堿或酶的催化作用下可以水解為奎寧酸和沒(méi)食子酸[2-4]。工業(yè)上,通常采用塔拉粉水解制備沒(méi)食子酸,該過(guò)程廢液中會(huì)殘存大量奎寧酸[5-6]。奎寧酸,通常于金雞納樹(shù)皮中提取加工獲得,又名金雞納酸[7],可以促進(jìn)鏈球菌的生成和促進(jìn)心、子宮等器官組織的發(fā)育[8],還可以作為飼料添加劑和改善酒精飲料口感、煙草增香劑的替代品等,其用途較為廣泛[9-10]。沒(méi)食子酸,化學(xué)名稱(chēng)為3,4,5-三羥基苯甲酸,研究表明沒(méi)食子酸對(duì)人體健康存在多種有益效果,具有抗炎[11]、抗突變[12]、抗氧化[13]、抗自由基[14]等多種功效。目前,針對(duì)奎寧酸及沒(méi)食子酸的檢測(cè)方法主要以HPLC法為主,但至今仍沒(méi)有制定統(tǒng)一的奎寧酸含量分析行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),測(cè)定樣品時(shí)需要對(duì)流動(dòng)相、配比、流速、柱溫等條件進(jìn)行相應(yīng)的選擇[15-18]。本研究建立了一種同時(shí)分析塔拉粉酶解廢液中奎寧酸和沒(méi)食子酸的HPLC方法,將廢液中各組分進(jìn)行分離,并對(duì)其中沒(méi)食子酸和奎寧酸含量進(jìn)行檢測(cè);同時(shí)通過(guò)指紋圖譜、相似度、聚類(lèi)分析等手段對(duì)不同批次塔拉粉酶解廢液進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為進(jìn)一步從廢液中回收奎寧酸提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

塔拉粉酶解廢液,由四川亭江新材料股份有限公司提供。三氟乙酸(色譜純)、乙腈(色譜純)、沒(méi)食子酸(純度99%),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度≥99%),東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

島津LC AB20高效液相色譜(HPLC)儀(帶自動(dòng)進(jìn)樣器),日本島津公司;Zorbax C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),安捷倫儀器有限公司。

1.2 色譜條件

采用Zorbax C18 色譜柱,流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序?yàn)?0～5 min 95% A,5～7 min 80% A,7 min以后95% A;UV檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm,柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,運(yùn)行時(shí)間7 min。

1.3 試樣制備

取塔拉粉酶解廢液10 mL,抽濾過(guò)0.45 μm濾膜,然后取抽濾后液體1 mL加水定容至100 mL,并根據(jù)要求進(jìn)行稀釋,即得試樣溶液。將所得試樣溶液過(guò)0.22 μm濾膜至2 mL透明螺紋口樣品瓶中,待測(cè)。

1.4 奎寧酸和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取(105±2) ℃下烘干至質(zhì)量恒定的奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品200 mg,加水超聲波處理至完全溶解,定容至10 mL,即得20 g/L奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用倍比稀釋法,將20 g/L奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至10、 5、 2.5和1.25 g/L,然后將所得系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)0.22 μm濾膜至2 mL透明螺紋口樣品瓶中,待測(cè)。

準(zhǔn)確稱(chēng)取(105±2) ℃下烘干至質(zhì)量恒定的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品100 mg,加水超聲波處理至完全溶解,定容至100 mL,即得1 g/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用倍比稀釋法,將1 g/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為0.5、 0.25、 0.125和0.062 5 g/L,然后將所得系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)0.22 μm濾膜至2 mL透明螺紋口樣品瓶中,待測(cè)。

按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC儀測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制奎寧酸與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 混合對(duì)照樣品制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取(105±2) ℃下烘干至質(zhì)量恒定的奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品200 mg、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg,加水超聲波處理至完全溶解,定容至10 mL,即得20 g/L奎寧酸和1 g/L沒(méi)食子酸的混合對(duì)照樣品溶液,采用倍比稀釋法,稀釋為10 g/L奎寧酸和0.5 g/L沒(méi)食子酸、 5 g/L奎寧酸和0.25 g/L沒(méi)食子酸混合對(duì)照樣品溶液。

1.6 方法學(xué)考察試驗(yàn)

1.6.1精密度試驗(yàn)

1.6.1.1日內(nèi)精密度 按1.3節(jié)制備試樣1份,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),于1日內(nèi)間隔3 h連續(xù)測(cè)試該試樣溶液6次,計(jì)算RSD值。

1.6.1.2日間精密度 按1.3節(jié)制備試樣1份,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),3日內(nèi)每日重復(fù)測(cè)試該試樣溶液3次,計(jì)算RSD值。

1.6.2重復(fù)性試驗(yàn) 按1.3節(jié)制備試樣6份,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算RSD值。

1.6.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.3節(jié)制備試樣6份,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間為定性標(biāo)準(zhǔn),分別于制樣后0、 2、 4、 8、 12和24 h測(cè)試試樣溶液,計(jì)算RSD值。

1.6.4加樣回收試驗(yàn) 精密移取已測(cè)定奎寧酸及沒(méi)食子酸含量的試樣3份,每份0.5 mL,分別加入1.5節(jié)制備的混合對(duì)照樣品溶液0.5 mL,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算加樣回收率。

1.7 指紋圖譜建立

取12批次塔拉粉酶解廢液,按1.3節(jié)方法制備試樣溶液,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,記錄色譜圖和相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012A 版)對(duì)12批次試樣的HPLC圖譜進(jìn)行分析。

1.8 聚類(lèi)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件,以12批次塔拉粉酶解廢液HPLC峰面積為變量,對(duì)12批次試樣進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.9 含量計(jì)算

廢液中奎寧酸和沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度按下式計(jì)算:

X=C×V×n/V0

式中:X—廢液中奎寧酸或沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度,g/L;C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣溶液中奎寧酸或沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度,g/L;V—試樣溶液定容體積,mL;V0—取抽濾后廢液體積,mL;n—試樣溶液稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng) 奎寧酸及沒(méi)食子酸紫外吸收光譜如圖1所示。由圖1可知,奎寧酸在190～250 nm范圍內(nèi)紫外吸收隨波長(zhǎng)增加而下降,在250～500 nm范圍內(nèi)紫外吸收幾乎為0;而沒(méi)食子酸存在2個(gè)吸收峰,其波長(zhǎng)分別為215和265 nm。如圖2所示,1分子塔拉單寧可以水解產(chǎn)生4～6分子沒(méi)食子酸和1分子奎寧酸,故酶解液中奎寧酸含量相對(duì)較低。溶劑的紫外截止波長(zhǎng)是指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí),溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收,它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量?？紤]到截止波長(zhǎng)對(duì)光譜產(chǎn)生的影響,選擇215 nm作為奎寧酸與沒(méi)食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 塔拉單寧水解過(guò)程

2.1.2流動(dòng)相選擇 對(duì)比了不同的流動(dòng)相體系,包括甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、丙酮-0.1%三氟乙酸水溶液,由于各流動(dòng)相紫外吸收截止波長(zhǎng)不同,乙腈、甲醇和丙酮的紫外吸收截止波長(zhǎng)分別為190、 205和330 nm,由于小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí),溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收影響試驗(yàn)結(jié)果,故紫外吸收截止波長(zhǎng)對(duì)工作波長(zhǎng)215 nm影響最小的乙腈為最佳流動(dòng)相[19]。

2.1.3流動(dòng)相梯度、流速、柱溫選擇 考察了不同流動(dòng)相梯度、流速和柱溫,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3中不同流速、柱溫的對(duì)比結(jié)果可知,提高流速會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間過(guò)早、易受溶劑峰等因素影響,柱溫對(duì)出峰時(shí)間影響不大。流動(dòng)相乙腈梯度為5%～20%、 5%～40%、 5%～60%、 5%～80%時(shí),對(duì)出峰時(shí)間無(wú)顯著影響,故選擇5%～20%乙腈為流動(dòng)相。綜合考慮,選擇流速1.0 mL/min、乙腈梯度5%～20%、柱溫30 ℃作為高效液相色譜工作條件。

圖3 流動(dòng)相(乙腈)梯度、流速和柱溫對(duì)比Fig.3 Comparison of flow phase(acetonitrile) gradient, flow velocity and column temperature

2.1.4奎寧酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按照1.4節(jié)條件繪制奎寧酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,并擬合線性回歸方程。經(jīng)測(cè)試,奎寧酸檢測(cè)限為0.5 g/L、沒(méi)食子酸檢測(cè)限為5 mg/L。奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為:y=280 722x-72 680(R2=0.999 6),線性范圍為1.25～20 g/L;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為:y=43 148 700x+1 983 150(R2=0.999 3),線性范圍為0.062 5～1 g/L。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1精密度試驗(yàn)

2.2.1.1日內(nèi)精密度 日內(nèi)精密度測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn),奎寧酸與沒(méi)食子酸峰面積范圍分別為1 325 613～1 334 174、 18 832 967～19 080 484(n=6),保留時(shí)間范圍分別為3.17～3.18 min、 3.92～3.98 min(n=6),峰面積RSD分別為0.241%、 0.496%(n=6),保留時(shí)間RSD分別為0.129%、 0.579%(n=6),均小于5%,說(shuō)明該方法日內(nèi)精密度良好。

2.2.1.2日間精密度 日間精密度測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn),奎寧酸與沒(méi)食子酸峰面積范圍分別為1 283 069～1 397 839、 17 653 576～18 878 864(n=9),保留時(shí)間分別為3.16～3.29 min、 3.89～4.18 min(n=9),峰面積RSD分別為2.390%、 2.827%(n=9),保留時(shí)間RSD分別為1.334%、 3.006%(n=9),均小于5%,說(shuō)明該方法日間精密度良好。

2.2.2重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),奎寧酸與沒(méi)食子酸峰面積范圍分別為1 096 959～1 183 619、 16 862 905～17 480 248(n=6),保留時(shí)間分別為3.13～3.16 min、 3.88～3.89 min(n=6),峰面積RSD分別為3.152%、 1.538%(n=6),保留時(shí)間RSD分別為0.388%、 0.133%(n=6),均小于5%,說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),奎寧酸與沒(méi)食子酸峰面積范圍分別為1 236 521～1 284 303、 18 193 401～18 976 851(n=6),保留時(shí)間分別為3.20～3.35 min、 4.07～4.28 min(n=6),峰面積RSD分別為1.289%、 1.770%(n=6),保留時(shí)間RSD分別為2.178%、 1.883%(n=6),均小于5%,說(shuō)明該方法24 h內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性。

2.2.4加樣回收試驗(yàn) 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2,奎寧酸與沒(méi)食子酸平均加樣回收率分別為100.87%、 99.65%,奎寧酸與沒(méi)食子酸加樣回收率RSD分別為3.273%、 2.568%。

表1 加樣回收試驗(yàn)峰面積與質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果

表2 加樣回收率計(jì)算結(jié)果

2.3 指紋圖譜分析

混合對(duì)照品的HPLC圖譜見(jiàn)圖4。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012A 版)對(duì)12批次試樣的HPLC圖譜進(jìn)行分析[20],HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖5。由圖5可以標(biāo)定出3個(gè)共有峰,通過(guò)與圖4混合對(duì)照品對(duì)比,共指認(rèn)出2個(gè)峰,分別為奎寧酸(1號(hào)峰)與沒(méi)食子酸(3號(hào)峰),將12批次廢液指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較,得到各個(gè)指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.95(表3),說(shuō)明不同批次廢液間樣品差異小,廢液內(nèi)容物穩(wěn)定。

表3 12批樣品與對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果

圖4 混合對(duì)照品的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of mixed reference substance

圖5 12批次廢液試樣(S1～S12)和對(duì)照品(R)指紋圖譜

2.4 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析可以將不同樣本按照性質(zhì)進(jìn)行分組,使得組間個(gè)體相似性較小[21]。將12批次廢液試樣標(biāo)定的奎寧酸與沒(méi)食子酸峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件,利用Z-得分對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以歐式平方距離為距離測(cè)度,采用組間連接法進(jìn)行Q型聚類(lèi),聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知,當(dāng)類(lèi)間距為5時(shí),12批次試樣被分為2類(lèi),S10與S11聚為一類(lèi),其余樣品聚為另一類(lèi),說(shuō)明10、 11號(hào)試樣與其他試樣差距較大,但總體來(lái)說(shuō)12批次廢液試樣樣品間差距較小。

圖6 12批次廢液試樣聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.6 12 batches of waste liquid samples clustering tree diagram

2.5 試樣含量計(jì)算結(jié)果

按1.3節(jié)制備試樣,按1.2節(jié)色譜條件,通過(guò)HPLC測(cè)試,連續(xù)進(jìn)樣3次,記錄色譜圖以及相應(yīng)峰面積,以保留時(shí)間作為定性標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算得到試樣中奎寧酸質(zhì)量濃度為482.3 g/L(平均保留時(shí)間3.191 min),沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為35.7 g/L(平均保留時(shí)間3.965 min)。

3 結(jié) 論

3.1首次對(duì)塔拉粉酶解廢液中2種主成分進(jìn)行測(cè)定,建立了同時(shí)檢測(cè)奎寧酸與沒(méi)食子酸的高效液相色譜方法,該方法選擇215 nm作為奎寧酸與沒(méi)食子酸檢測(cè)波長(zhǎng),色譜條件為流速1.0 mL/min、乙腈梯度5%～20%、柱溫30 ℃?？鼘幩針?biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1.25～20 g/L、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.062 5～1 g/L,奎寧酸與沒(méi)食子酸檢測(cè)限分別為0.5 g/L、 5 mg/L?？鼘幩崤c沒(méi)食子酸日內(nèi)精密度保留時(shí)間RSD分別為0.129%、 0.579%,日間精密度保留時(shí)間RSD分別為1.334%、 3.006%,重復(fù)性保留時(shí)間RSD分別為0.388%、 0.133%,穩(wěn)定性保留時(shí)間RSD分別為2.178%、 1.883%,平均加樣回收率分別為100.87%、 99.65%,平均加樣回收率RSD分別為3.273%、 2.568%。表明該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性強(qiáng),可以作為新方法彌補(bǔ)現(xiàn)有塔拉粉酶解廢液分析的不足。

3.2建立了塔拉粉酶解廢液指紋圖譜,共標(biāo)定出3個(gè)共有峰,相似度均大于0.95,說(shuō)明建立指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性與可控性,通過(guò)共有峰指認(rèn)可確定奎寧酸(1號(hào)峰)與沒(méi)食子酸(3號(hào)峰)。選取12批次廢液試樣進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果表明樣品間差距較小。

3.3對(duì)塔拉粉酶解廢液中奎寧酸與沒(méi)食子酸含量進(jìn)行計(jì)算,得到奎寧酸質(zhì)量濃度為482.3 g/L,沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為35.7 g/L。該方法填補(bǔ)了現(xiàn)有分析技術(shù)中對(duì)酶解塔拉粉制備沒(méi)食子酸廢液檢測(cè)方法的空白,同時(shí)為從塔拉粉酶解廢液中回收奎寧酸提供了基礎(chǔ)。