草甘膦脅迫對茶樹葉片中莽草酸含量的影響

劉洪霞，劉穎穎，陳紅平，柴云峰

草甘膦脅迫對茶樹葉片中莽草酸含量的影響

劉洪霞1,2，劉穎穎1,2，陳紅平1,3*，柴云峰1,3*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（杭州），浙江 杭州 310008

為探明草甘膦脅迫對茶樹生長及莽草酸代謝的影響，通過水培試驗(yàn)考察草甘膦對茶苗的表觀藥害，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對葉片中的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行非靶向分析，并對葉片中的莽草酸和草甘膦進(jìn)行定量測定。結(jié)果表明，高劑量草甘膦（200?mg·L-1）處理組茶苗出現(xiàn)藥害特征，而低劑量草甘膦（50?mg·L-1）處理組和對照組茶苗未出現(xiàn)表觀藥害。質(zhì)譜檢測和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸途徑代謝物的含量發(fā)生顯著變化，其中莽草酸是主要的差異代謝物之一。在試驗(yàn)期內(nèi)（0～21?d），茶樹葉片中莽草酸的積累量與草甘膦的吸收量和作用時(shí)間高度正相關(guān)，當(dāng)草甘膦吸收量達(dá)到28?mg·kg-1以上時(shí)，茶樹的莽草酸代謝受到明顯抑制，導(dǎo)致葉片中莽草酸大量積累，與對照組相比，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸的含量約高16倍。本研究表明莽草酸是茶樹響應(yīng)草甘膦脅迫的主要代謝物之一。

茶樹；草甘膦；莽草酸；藥害；液質(zhì)聯(lián)用

我國茶園面積和茶葉產(chǎn)量均居世界首位，許多優(yōu)質(zhì)茶園處于山地或丘陵，不利于機(jī)械化作業(yè)，人工除草雖然綠色環(huán)保，但成本高且效率低，化學(xué)除草劑成為高山茶園除草的重要手段。草甘膦（Glyphosate）是目前世界上使用最廣泛的除草劑[1]，因其價(jià)格低廉、殺草譜廣、除草效果好等特點(diǎn)，也常被用于茶園除草。研究表明，草甘膦急性毒性較低，但是經(jīng)過植物富集再經(jīng)食物鏈被人類長期食用會對人體健康造成潛在威脅[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期使用草甘膦會破壞土壤微生態(tài)[3]，而且土壤中殘留的草甘膦會隨地表徑流進(jìn)入地表水，對水生態(tài)環(huán)境造成影響[4]。此外，在殺滅雜草的同時(shí)，土壤中的草甘膦可以被作物根系吸收富集于葉片[5]。研究表明，草甘膦會影響植物碳循環(huán)及光合作用[6-7]，對植物生長造成影響，導(dǎo)致玉米[8]、燕麥、蠶豆[9]等作物減產(chǎn)，小麥[10-11]在施用草甘膦后體內(nèi)莽草酸水平出現(xiàn)明顯上升，芳香族氨基酸含量出現(xiàn)明顯波動。

茶樹是草甘膦的非靶標(biāo)植物，茶園正常使用草甘膦不易使茶樹產(chǎn)生藥害[5,12]。但是，Tong等[13]通過水培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的草甘膦會造成茶樹死亡。草甘膦對茶樹代謝影響的研究較少，郭永春等[14]發(fā)現(xiàn)草甘膦可顯著改變茶樹葉片中游離氨基酸、兒茶素和生物堿類化合物的含量，近期他們又利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）方法鑒定得到2個與草甘膦響應(yīng)高度相關(guān)的關(guān)鍵基因模塊以及茶樹抵御草甘膦逆境過程中6個關(guān)鍵調(diào)控基因，發(fā)現(xiàn)草甘膦能夠干擾茶樹葉片中的莽草酸代謝[15]。

草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生除草劑，其作用機(jī)制是通過競爭性抑制植物莽草酸代謝途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPs）的活性，使植物無法正常合成生長所必需的芳香族氨基酸，從而導(dǎo)致植物死亡。莽草酸作為草甘膦抑制莽草酸代謝途徑的積累產(chǎn)物，其含量能夠很好地反映植物對草甘膦的敏感性或草甘膦對植物的毒性[16-17]。不同濃度草甘膦脅迫下茶葉中莽草酸的變化規(guī)律未見報(bào)道。本研究通過觀測施用不同濃度草甘膦后水培茶苗的表觀藥害，并對茶樹葉片中的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行分析和差異比較，探討莽草酸是否是茶樹葉片中受草甘膦影響的主要代謝物，研究莽草酸含量變化對不同濃度草甘膦脅迫的敏感性。

1 材料與方法

1.1 茶苗水培試驗(yàn)

將一年生龍井43茶苗分為3組，洗凈根部泥土后置于盛有去離子水的培養(yǎng)箱中，氣泵增氧，培養(yǎng)一周，隨后將純水更換為營養(yǎng)液，營養(yǎng)液由1/8濃度開始，由低到高逐步更換至全營養(yǎng)液，并在兩組全營養(yǎng)液中添加不同濃度草甘膦銨鹽，按有效成分計(jì)算使?fàn)I養(yǎng)液中的草甘膦質(zhì)量濃度分別達(dá)到50?mg·L-1和200?mg·L-1。于0?d（添加草甘膦前）及添加后1、2、3、7、14、21?d采集整株茶苗為樣本，拍照記錄其葉片表觀形態(tài)。包括空白對照組（CK）在內(nèi)，每次每組取3株茶苗進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。將樣本茶苗的全部葉片剝離并置于研缽中加入液氮研磨成粉狀，用于草甘膦及茶葉代謝物測定。

1.2 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Q-Exactive-Orbitrap HRMS，美國Thermo Fisher公司），超高效液相色譜儀（UltiMate 3000 UHPLC，美國Thermo Fisher公司），多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

試劑：草甘膦銨鹽（有效成分68%）購自浙江金帆達(dá)生物有限公司，同位素內(nèi)標(biāo)[1,2-13C2,15N]-草甘膦（質(zhì)量濃度100?mg·L-1）和草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）和甲酸（色譜純）購自上海麥克林公司，氫氧化鉀（分析純）購自杭州蕭山化學(xué)試劑廠，鹽酸（優(yōu)級純）購自江蘇永華精細(xì)化學(xué)廠，四硼酸鈉（99.5%）購自太倉美達(dá)試劑有限公司，氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）購自美國APExBIO公司，甲醇和乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 茶鮮葉中代謝物測定

茶鮮葉經(jīng)液氮研磨成粉后，稱取0.50?g置于15?mL離心管中，加入10?mL 70%甲醇溶液，超聲、渦旋后于冰箱冷藏靜置過夜。提取液經(jīng)10?000?r·min-1離心后取1?mL上清液過0.22?μm有機(jī)系濾膜，待測。

色譜條件：安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），柱溫為35?℃。流動相為含0.1%甲酸的水溶液（A相）及甲醇（D相），流動相洗脫程序?yàn)??min，10% D相；10?min，95% D相；11?min，5% D相；15?min，5% D相。流速為0.3?mL·min-1，進(jìn)樣量為3?μL。

質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI）正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，噴霧電壓3.5?kV（ESI+）和3.2?kV（ESI-），毛細(xì)管溫度320?℃，輔助氣溫度300?℃，鞘氣（N2）35?arb，輔助氣（N2）12?arb，質(zhì)譜掃描范圍為/100～1?200。

1.3.2 茶鮮葉中草甘膦的測定

茶鮮葉中草甘膦的檢測參照本實(shí)驗(yàn)室及其他實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的方法[13,18]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。

提?。悍Q取0.50?g液氮磨碎后的茶葉置于15?mL離心管并加入60?μL草甘膦同位素內(nèi)標(biāo)溶液（10?mg·L-1），然后加入3.75?mL KOH溶液（50?mmol·L-1），搖勻后，超聲20?min。經(jīng)離心（4?700?r·min-1）后取2?mL上清液至5?mL離心管內(nèi)，加入5?mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性，振蕩搖勻后經(jīng)離心（5?000?r·min-1）得到上清液。

凈化：取1?mL上清液過Oasis HLB小柱（美國Waters公司，小柱活化：2?mL甲醇淋洗后加2?mL水活化），流出的凈化液接入2?mL離心管。

衍生：凈化液中加入0.25?mL硼酸鈉緩沖溶液，搖勻后，再加入0.35?mL FMOC-Cl衍生試劑（10?mg·mL-1），振蕩搖勻后，靜置2?h以上，10?000?r·min-1離心10?min，取上清液過0.22?μm有機(jī)系濾膜，待測。

色譜條件：色譜柱為安捷倫Eclipse Plus C18（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），柱溫40?℃，流速為0.3?mL·min-1，進(jìn)樣量為1?μL。使用0.1%甲酸水溶液（A相）和甲醇（D相）進(jìn)行二元梯度洗脫，洗脫程序?yàn)??min，10% D相；10.0?min，100% D相；11.0?min，100% D相；11.1?min，10% D相；14.0?min，10% D相。

質(zhì)譜條件同1.3.1章節(jié)。

1.3.3 茶鮮葉中莽草酸的測定

提取：茶鮮葉經(jīng)液氮研磨成粉后，稱取0.50?g置于15?mL離心管中，加入10?mL 70%甲醇溶液浸泡1?h以上，超聲10?min。提取液經(jīng)10?000?r·min-1離心，上清液用0.5?mmol·L-1的KOH溶液稀釋100倍，待測。

色譜條件：接色譜保護(hù)柱（SeQuant，德國默克公司），不接色譜柱，流速為0.3?mL·min-1，進(jìn)樣量為2?μL。使用乙腈（B相）和純水（C相）進(jìn)行等度洗脫（50∶50）。分析時(shí)間為1?min。

質(zhì)譜條件同1.3.1章節(jié)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密稱取莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水溶解配制成1.0?mg·mL-1儲備液，然后稀釋成100?mg·L-1的儲備液并置于4?℃條件下備用。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：以0.5?mmol·L-1KOH水溶液為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0?mg·L-1和2.5?mg·L-1的莽草酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：稱取未用草甘膦處理的茶鮮葉粉末0.50?g，按照樣品提取方法進(jìn)行提取和稀釋，以此溶液為溶劑分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0?mg·L-1和2.5?mg·L-1的莽草酸基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）計(jì)算公式：=(－1)×100%，公式中的和分別代表基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用TraceFinder 3.0、Excel 2019和Compound Discoverer 2.0（CD）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0繪制草甘膦和莽草酸的檢測結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對茶樹生長及代謝的影響

2.1.1 茶樹葉片表觀藥害觀察

文獻(xiàn)報(bào)道水培營養(yǎng)液中草甘膦質(zhì)量濃度達(dá)到200?mg·L-1以上時(shí)，茶樹表現(xiàn)出明顯的藥害特征[13]。本研究設(shè)置50?mg·L-1草甘膦處理、200?mg·L-1草甘膦處理和空白對照3個水培茶苗試驗(yàn)組。在施藥后的21?d內(nèi)對茶苗生長狀況進(jìn)行觀察。茶苗中間部位成熟葉片的照片如圖1所示，50?mg·L-1草甘膦處理組茶苗葉片在整個觀測期間均未發(fā)生藥害；200?mg·L-1草甘膦處理組茶苗葉片在前14?d觀測期未出現(xiàn)表觀異?，F(xiàn)象，直到21?d茶苗部分葉片開始向后卷曲，葉脈兩側(cè)出現(xiàn)不規(guī)則褐斑且葉片易脫落（輕微觸碰或者搖晃枝條即造成葉片脫落）。本研究觀測試驗(yàn)證實(shí)了水培營養(yǎng)液中添加較高質(zhì)量濃度的草甘膦（200?mg·L-1）后，茶苗表現(xiàn)出明顯的藥害癥狀。

2.1.2 茶樹葉片中代表性代謝物變化分析

使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對水培21?d 3組茶樹葉片中的非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行分析，分析得到的原始圖譜采用CD軟件進(jìn)行峰匹配與峰面積提取，得到2?480個成分。對用藥組和對照組中存在顯著差異（<0.01）的代謝物按峰面積比值（用藥組/對照組）大小進(jìn)行排序，其中差異最大（比值>10）的2個成分的精確分子量為174.052?8和172.037?4，通過高分辨質(zhì)譜元素組成分析得到它們可能的元素組成分別為C7H10O5（理論精確分子質(zhì)量174.052?8）和C7H8O5（理論精確分子質(zhì)量172.037?2），誤差均小于2.0×10-6。然后通過二級質(zhì)譜裂解分析和數(shù)據(jù)庫檢索推測化合物結(jié)構(gòu)，并最終用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確證，確定這2個化合物分別為莽草酸和3-脫氫莽草酸。

圖1 水培營養(yǎng)液中添加不同濃度草甘膦后茶苗葉片的觀察照片

草甘膦的作用機(jī)理是抑制植物體內(nèi)的莽草酸代謝途徑。對藥害組（200?mg·L-1草甘膦處理）和對照組茶樹葉片的莽草酸途徑中的主要代謝物的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2B所示。在藥害茶樹中，3-脫氫莽草酸和莽草酸的含量分別上升了約20.0倍和15.6倍；3-脫氫莽草酸的上游代謝物3-脫氫奎寧酸的含量升高了31%；莽草酸的下游代謝物苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的含量分別升高了199%、141%和111%。該結(jié)果表明，茶樹響應(yīng)草甘膦脅迫的重要特征是莽草酸和3-脫氫莽草酸的大量積累，并且莽草酸途徑中的其他代謝物也有一定程度積累，但受影響程度明顯偏小，其中一個異常的現(xiàn)象是莽草酸下游代謝物芳香氨基酸的含量也會顯著升高。圖2C顯示，在試驗(yàn)期內(nèi)，200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中3種芳香氨基酸的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積呈先下降后逐漸升高的趨勢。郭永春等[14]在研究草甘膦對土培茶樹葉片主要生化成分的影響時(shí)，也觀察到了茶葉中氨基酸含量的波動變化，其中施用草甘膦7?d時(shí)，茶葉中苯丙氨酸含量升高了140%。這些現(xiàn)象與草甘膦抑制植物芳香氨基酸的合成作用機(jī)理不一致[19]，可能是茶樹存在特殊的代謝機(jī)制來抵抗草甘膦脅迫，該現(xiàn)象在后續(xù)工作中值得進(jìn)一步研究。類似的現(xiàn)象在雜草香附子中也有發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理后的香附子中莽草酸大量積累，但是芳香氨基酸的含量并不減少，研究者認(rèn)為可能是蛋白質(zhì)水解提供芳香氨基酸[20]。此外，茶葉中典型的多酚化合物如沒食子酸、表兒茶素和蕓香苷以及茶葉主要次生代謝物咖啡堿和茶氨酸的含量在藥害茶樹中略有下降，但不顯著。茶樹葉片中代謝物的UHPLC-HRMS分析結(jié)果表明，草甘膦主要影響茶樹莽草酸代謝途徑。因此，研究莽草酸途徑的主要代謝物莽草酸含量與草甘膦吸收量的變化規(guī)律將有助于揭示茶樹對草甘膦脅迫的應(yīng)答機(jī)制。為了準(zhǔn)確測定水培茶樹葉片中莽草酸和草甘膦的含量，需進(jìn)一步對它們進(jìn)行靶向定量分析。

注：A為莽草酸代謝途徑，B為21?d對照組和200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中代表性化合物的質(zhì)譜峰面積，C為200 mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中3種芳香氨基酸質(zhì)譜峰面積的時(shí)間變化趨勢。*、**和***分別表示在P<0.05，0.01，0.001下差異顯著

2.2 草甘膦脅迫下茶樹葉片中莽草酸含量的變化分析

2.2.1 高分辨質(zhì)譜法快速測定茶樹葉片中莽草酸的含量

莽草酸是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的有機(jī)酸。目前，其含量測定方法有氣相色譜法（GC）、分光光度法（SRT）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）等[21]。質(zhì)譜儀本身是一種高效分離儀器，可按分析物的質(zhì)荷比（）實(shí)現(xiàn)空間或時(shí)間上的區(qū)分。尤其是近年來高分辨質(zhì)譜的廣泛使用，使得我們能通過精確質(zhì)量數(shù)將目標(biāo)分子從復(fù)雜基質(zhì)的眾多質(zhì)譜信號中分離提取出來，從而實(shí)現(xiàn)混合物中單一目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量[22]?；赒-Exactive Orbitrap HRMS的高靈敏度、高分辨率和高質(zhì)量精度等優(yōu)點(diǎn)，建立了一種新穎的莽草酸快速定量方法，該方法采用流動注射分析-質(zhì)譜聯(lián)用（Flow injection analysis-mass spectrometry，F(xiàn)IA-MS）[23]，不使用色譜分離，只使用高分辨質(zhì)譜對目標(biāo)離子進(jìn)行提取和定量。

使用ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描模式對莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，莽草酸在ESI負(fù)模式下響應(yīng)更高，這是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中的羧基基團(tuán)容易失去質(zhì)子形成穩(wěn)定的莽草酸負(fù)離子，因此本試驗(yàn)選擇ESI負(fù)模式檢測。優(yōu)化后的莽草酸選擇離子流圖（EIC）和全掃描一級質(zhì)譜圖如圖3所示。莽草酸的[M-H]-離子的EIC峰形較好，該離子理論值為173.045?5，實(shí)測值為173.045?4，誤差小于2×10-6，因此選擇該離子為定性和定量離子。

2.2.2 方法驗(yàn)證

為驗(yàn)證該方法的可行性，采用1.3.3章節(jié)制備的各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按指定色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。莽草酸在0.01～2.50?mg·L-1線性良好，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（2）都大于0.999，定量限為0.01?mg·L-1。由于茶鮮葉提取物中成分復(fù)雜，且該方法不使用色譜進(jìn)行分離，因此該方法存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，計(jì)算得到的基質(zhì)效應(yīng)為–42%。為消除基質(zhì)效應(yīng)，本研究采用相應(yīng)基質(zhì)匹配標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn)。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算茶葉中莽草酸本底含量（C0），C0即基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與橫坐標(biāo)交點(diǎn)處的絕對值。C為不同的基質(zhì)加標(biāo)濃度，以莽草酸進(jìn)樣濃度（C+C0）為橫坐標(biāo)，莽草酸的質(zhì)譜響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)建立校正標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用校正標(biāo)準(zhǔn)曲線對茶葉中的莽草酸進(jìn)行定量分析，校正標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為=3.63e8+3.94e5，2為0.999?8。

取0.50?g液氮磨碎的鮮葉樣品，分別加入當(dāng)量為80、400?mg·kg-1和2?000?mg·kg-1的莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照前述方法每個添加水平重復(fù)分析6次，結(jié)果如表1所示，平均回收率為79.1%～102.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為3.5%～10.1%。對質(zhì)量濃度為0.04?mg·L-1和1.0?mg·L-1的莽草酸基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD分別為2.0%和4.0%，方法精密度良好。結(jié)果表明，本研究建立的莽草酸定量方法樣品前處理簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，每個樣品的儀器分析時(shí)間只需1?min，尤其適合實(shí)驗(yàn)室樣品的高通量分析。

圖3 莽草酸的選擇離子流圖和全掃描一級質(zhì)譜圖

表1 茶鮮葉中莽草酸的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.2.3 茶樹葉片中莽草酸含量的動態(tài)變化

運(yùn)用上述方法對3組水培茶苗在施藥前（0?d）及施藥后（1、2、3、7、14、21?d）采集的63個鮮葉樣品中的莽草酸進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4A所示。整個試驗(yàn)期間，對照組茶樹葉片中莽草酸的平均含量在93～313?mg·kg-1，14?d后有所下降。50?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中的莽草酸含量在前7?d與對照組沒有明顯差異，在14?d和21?d明顯升高，平均含量分別為469?mg·kg-1和1?015?mg·kg-1。200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中的莽草酸含量在前2?d與對照組沒有明顯差異，從3?d開始明顯升高，后期呈加速上升趨勢，至21?d觀察到藥害癥狀時(shí)，葉片中莽草酸的平均含量為2?014?mg·kg-1。

2.3 茶樹葉片中草甘膦含量的變化分析

2.3.1 草甘膦檢測方法驗(yàn)證

采用對照組的茶鮮葉作為空白樣品，按照1.3.2章節(jié)進(jìn)行提取和凈化，得到空白基質(zhì)溶液，精確吸取一定量的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級用空白基質(zhì)溶液稀釋成8個質(zhì)量濃度梯度（0.025、0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、15?mg·L-1）的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按照1.3.2章節(jié)進(jìn)行衍生和檢測。以草甘膦濃度（X）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品與同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，草甘膦在0.025～15?mg·L-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（2）為0.999，定量限為0.025?mg·L-1。分別稱取0.50?g對照組鮮葉于離心管中，添加當(dāng)量為1.0、10.0、50.0?mg·kg-1的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度水平重復(fù)5次，按照1.3.2章節(jié)的方法進(jìn)行前處理和檢測，結(jié)果顯示，草甘膦加標(biāo)的平均回收率為86.0%～113.7%，RSD（n=5）為1.4%～3.7%。該方法滿足本次茶樹葉片中草甘膦含量的檢測要求。

圖4 不同質(zhì)量濃度草甘膦處理茶苗葉片中的莽草酸（A）和草甘膦（B）含量變化趨勢

2.3.2 茶樹葉片中草甘膦含量的動態(tài)變化

對草甘膦處理組水培茶苗施藥后1、2、3、7、14、21?d采集的鮮葉樣品中的草甘膦進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖4B所示。施藥后1?d，50?mg·L-1和200?mg·L-1草甘膦處理組的茶樹葉片中檢測到的草甘膦平均含量分別達(dá)到1.9?mg·kg-1和7.7?mg·kg-1，說明茶樹對草甘膦有較強(qiáng)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力。隨著試驗(yàn)進(jìn)程，茶樹葉片中的草甘膦含量逐漸升高，至14?d達(dá)到最高值。結(jié)果顯示，水培營養(yǎng)液中草甘膦濃度越高，葉片吸收草甘膦的速率越大、積累量越高。21?d觀察到藥害時(shí)，50?mg·L-1和200?mg·L-1草甘膦處理組茶樹葉片中草甘膦的平均積累量有所下降，分別為27.0?mg·kg-1和94.5?mg·kg-1。

2.4 草甘膦對茶樹莽草酸代謝的影響

不同植物對草甘膦的敏感度和抗性有較大差異，其中一個主要評價(jià)指標(biāo)是莽草酸含量的變化。油菜在草甘膦處理后6?h即觀察到莽草酸的大量積累（約26倍）[24]，咖啡樹在草甘膦處理后7?d才觀察到莽草酸的明顯積累（約1倍）[25]，而抗草甘膦棉花在用草甘膦處理后莽草酸沒有顯著的積累[26]。對不同濃度草甘膦處理的茶樹葉片中莽草酸和草甘膦的定量分析表明，茶樹葉片中莽草酸的積累量和草甘膦吸收量具有顯著的正相關(guān)性。整個試驗(yàn)期內(nèi)（0～21?d），葉片中草甘膦的吸收量前14?d持續(xù)升高，隨后呈下降趨勢。與對照組相比，低劑量草甘膦處理組（50?mg·L-1）茶樹葉片中莽草酸的含量在14?d才開始顯著升高，對應(yīng)葉片中草甘膦的平均含量為28.4?mg·kg-1；而高劑量草甘膦處理組（200?mg·L-1）茶樹葉片中的莽草酸含量在3?d即明顯升高，對應(yīng)葉片中草甘膦的平均含量為40.1?mg·kg-1，說明茶樹莽草酸代謝對草甘膦脅迫的敏感性與草甘膦吸收量有關(guān)，吸收量越高，草甘膦對茶樹莽草酸代謝途徑的抑制越明顯，本研究得到的草甘膦造成茶樹葉片中莽草酸顯著積累的閾值為28～40?mg·kg-1。此外茶樹葉片中莽草酸的積累量與草甘膦的作用時(shí)間有關(guān)，14?d以后，低劑量和高劑量草甘膦處理組茶樹葉片中的草甘膦含量都有所下降，但是14～21?d，它們的莽草酸含量都升高了1倍以上，說明被葉片吸收的草甘膦能夠持續(xù)抑制茶樹的莽草酸代謝途徑，導(dǎo)致莽草酸大量積累，發(fā)生藥害的茶樹葉片中莽草酸的含量比未用草甘膦處理的正常茶樹葉片高約16倍。

3 討論與結(jié)論

莽草酸途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，莽草酸是植物中芳香氨基酸、多酚、生物堿等眾多品質(zhì)成分的合成前體，莽草酸途徑的代謝紊亂可能造成下游代謝物含量的變化。前人研究表明，草甘膦能夠通過茶樹根系吸收，經(jīng)莖部轉(zhuǎn)運(yùn)富集于葉片，高濃度草甘膦會使茶樹葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)并最終脫落，低濃度草甘膦即使不造成藥害，也會明顯改變茶樹葉片中主要生化成分的含量[5,13-14]。本研究通過觀察不同濃度草甘膦處理的水培茶苗葉片的表觀藥害，并使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析茶樹葉片中的代謝物，發(fā)現(xiàn)高劑量的草甘膦能夠?qū)е虏铇浒l(fā)生藥害，藥害組茶葉中莽草酸途徑相關(guān)代謝物含量顯著升高，其中莽草酸和脫氫莽草酸是含量上升最大的兩種代謝物，而與莽草酸代謝途徑關(guān)系較小的典型的幾種多酚類化合物沒食子酸、表兒茶素和蕓香苷以及茶葉主要的品質(zhì)成分咖啡堿和茶氨酸的含量變化相對較小。本研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦能夠顯著抑制茶樹的莽草酸代謝途徑，但是下游芳香氨基酸的含量在一定時(shí)期內(nèi)反而明顯升高，該異?，F(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道[14]，發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。草甘膦對茶葉品質(zhì)成分的影響較為復(fù)雜，本研究的結(jié)果可為此類研究提供一定的理論參考。

植物體中莽草酸含量變化是判斷植物是否具有草甘膦抗性的重要生理指標(biāo)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，莽草酸是茶樹響應(yīng)草甘膦脅迫的主要代謝物之一，草甘膦對茶樹莽草酸途徑具有明顯的抑制作用，造成葉片中莽草酸的積累，積累量與草甘膦劑量和作用時(shí)間正相關(guān)。該結(jié)果表明，草甘膦對茶樹生長和代謝的影響可能也是抑制莽草酸代謝途徑中的EPSPs酶，造成莽草酸無法向下游代謝物轉(zhuǎn)化，與草甘膦在其他植物中的致毒機(jī)制類似。因此，研究草甘膦脅迫下茶葉中莽草酸含量的變化規(guī)律有助于了解茶樹對草甘膦的抗性和研究茶樹應(yīng)對草甘膦脅迫的代謝機(jī)制。

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Glyphosate-stress Effects on Shikimic Acid in Tea Leaves

LIU Hongxia1,2, LIU Yingying1,2, CHEN Hongping1,3*, CHAI Yunfeng1,3*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea (Hangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

To investigate the effect of glyphosate stress on the growth and shikimic acid metabolism of tea (L) plants, tea seedlings were cultured in nutrient solution with different concentrations of glyphosate and the visual phytotoxicity on tea leaves was observed. The non-targeted analysis of non-volatile metabolites in the leaves and quantitative determination of shikimic acid and glyphosate in the leaves were carried out by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry. The results show that the tea seedlings under the high dose of glyphosate (200?mg·L-1) treatment exhibited characteristics of pesticide damage, while the tea seedlings under the low dose of glyphosate (50?mg·L-1) treatment and control did not show apparent pesticide damage. Mass spectrometric and statistical analysis indicates that there were significant changes in the contents of shikimic acid pathway metabolites in the leaves of glyphosate-treated tea seedlings, with shikimic acid being one of the main differential metabolites. Within 21?d, the accumulation of shikimic acid in leaves was highly positively correlated with the absorption amount and action time of glyphosate. When the absorption amount of glyphosate was larger than 28?mg·kg-1, the shikimic acid metabolism in tea plants was significantly inhibited, resulting in a large accumulation of shikimic acid in tea leaves. Compared with the control group, the content of shikimic acid in tea leaves affected by pesticides increased about 16-fold. This study shows that shikimic acid is one of the main metabolites of tea plants in response to glyphosate stress.

tea plant, glyphosate, shikimic acid, phytotoxicity, LC-MS

S571.1；S482

A

1000-369X(2023)05-657-10

2023-03-08

2023-07-09

國家自然科學(xué)基金（21775164）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-23）、三農(nóng)九方項(xiàng)目（2022SNJF037）

劉洪霞，女，碩士研究生，主要從事茶葉質(zhì)量安全研究。*通信作者：thean27@tricaas.com；chaiyunfeng@tricaas.com